Полиартрит мкб: описание болезни в справочнике МКБ-10 РЛС.

Содержание

M13.8 – Другие уточненные артриты

Входит в группу: M13 – Другие артриты

Препараты нозологической группы M13. 8

Найдено препаратов:4

Гидрокортизон+Лидокаин-Бинергия

Суспензия д/внутрисуставного и околосуставного введения 25 мг+5 мг/мл: 5 мл фл.

рег. №: ЛП-006556 от 09.11.20
Комбалгин® Айс

Гель д/наружн. прим. 5%+3%: тубы 15 г, 25 г, 30 г, 50 г, 75 г или 100 г

рег. №: ЛП-007196 от 20.07.21
Некст

Таб., покр. пленочной оболочкой, 400 мг+200 мг: 2, 4, 6, 10, 12, 20 или 24 шт.

рег. №: ЛП-001389 от 20.12.11 Дата перерегистрации: 12.12.18
Некст Активгель

Гель д/наружн.

прим. 50 мг+30 мг/1 г: туба 50 г

рег. №: ЛП-005334 от 04.02.19

Другие подгруппы из нозологической группы: Другие артриты

Ревматоидный артрит > Клинические протоколы МЗ РК

Сокращения, используемые в протоколе:
АРР – Ассоциация ревматологов России
АЦЦП – антитела к циклическому цитруллинированному пептиду
БПВП – базисные противовоспалительные препараты
ВАШ – Визуальная Аналоговая шкала
ГИБП – генно-инженерные биологические препараты
ГИБТ – генно-инженерная биологическая терапия
ГК – глюкокортикостероиды
ЖКТ – желудочно-кишечный тракт
ЗППП – заболевания, передающиеся половым путем
ЛС – лекарственные средства
МТ – метотрексат
ЛЕФ – лефлуномид
СС – сульфасалазин
ООСЗ – общая оценка состояния здоровья
МРТ – магниторезонансная томография
НПВП – нестероидные противовоспалительные препараты
ОСЗ – общее состояние здоровья
РА – ревматоидный артрит
РФ – ревматоидный фактор
СРБ — С-реактивный белок
УЗИ – ультразвуковое исследование
ФК – функциональный класс
ЧПС- число припухших суставов
ЦОГ – циклооксигеназа
ФГДС – фиброгастродуоденоскопия
ФНО-α — фактор некроза опухолей-альфа
ЭКГ – электрокардиограмма
ЭХО КГ – эхокардиограмма
EULAR- Европейская антиревматическая лига (European League Against Rheumatism)
ACR- Американская Коллегия ревматологов (American College of Rheumatology)

Список разработчиков протокола:
1)    Турдалин Нурлан Бостыбаевич – кандидат медицинских наук, директор ГКП на ПХВ «Городской ревматологический центр» Управления Здравоохранения г. Алматы, главный внештатный ревматолог МЗСР РК.
2)      Габдулина Гулжан Хамзенична – кандидат медицинских наук, доцент кафедры общей врачебной практики №1 «Казахский национальный медицинский университет им С.Д. Асфендиярова».
3)      Аубакирова Бакыт Амантаевна –  главный внештатный ревматолог г.Астана, руководитель Городского ревматологического центра при Городской поликлинике №7 Управления здравоохранения г.Астаны.
4)      Аманжолова Айнаш Сейдахметовна – Казахский Национальный медицинский Университет им. С.Д. Асфендиярова, кафедра общей врачебной практики №1 с курсом герантологии и гериатрии, ассистент.   
5)      Смагулова Газиза Ажмагиевна – доцент, кандидат медицинских наук, руководитель кафедры пропедевтики внутренних болезней и клинической фармакологии Западно-Казахстанского государственного медицинского университета им.М.Оспанова г.Актобе, клинический фармаколог.
 
Список рецензентов:
1)      Исаева Бакытшолпан Габдулхакимовна- доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой общей врачебной практики №1 «Казахский националный медициский университет  имени С. Д. Асфендиярова»,  ревматолог.
 
Конфликта интересов: нет.
 
Условия пересмотра: пересмотр протокола через 3 года после его опубликования и с даты его вступления в действие или при наличии новых методов с уровнем доказательности.

Приложение
Список использованной литературы по определению шкалы  уровня доказательности  основных лекарственных средств:
 
19. Management of early rheumatoid arthritis. (SIGN Guideline No 123). Available from:  http://www.sign.ac.uk/pdf/sign123.pdf
27. Maria E Suarez-Almazor,  Elaine Belseck,  Beverley Shea,  Peter Tugwell,  George A Wells.
Sulfasalazine for treating rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews . Assessed as up-to-date: 27 April 1998 DOI: 10.1002/14651858.CD000958.  Available from:  http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD000958/full
17. Singh J.A. et al. 2015 American College of Rheumatology Guideline for the Treatment of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Care & Research;  DOI 10.1002/acr.22783 VC 2015, American College of Rheumatology. Available from: http://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/ACR%202015%20RA%20Guideline.pdf
18. Rheumatoid arthritis in adults: management NICE guidelines [CG-79] Published date: February 2009. Last updated: December 2015. Available from: https://www.nice.org.uk/guidance/cg79/resources/rheumatoid-arthritis-in-adults-management-975636823525
19. Management of early rheumatoid arthritis. (SIGN Guideline No 123). Available from:  http://www.sign.ac.uk/pdf/sign123.pdf
20. Josef S. Smolen et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2013 update. Ann Rheum Dis. doi: 10.1136/annrheumdis-2013-204573. Available from:  http://ard.bmj.com/content/early/2013/10/23/annrheumdis-2013-204573.full
21. Lopez-Olivo MA, Siddhanamatha HR, Shea B, Tugwell P, Wells GA, Suarez-Almazor ME. Methotrexate for treating rheumatoid arthritis. Cochrane Database Syst Rev. 2014 Jun 10;(6):CD000957. doi: 10.1002/14651858.CD000957.pub2. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD000957.pub2/abstract;jsessionid=263E5B8747EFACDC3DE718A95D252CC3.f01t03  или http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24916606
22. Dhaon P, Das SK, Srivastava R, Agarwal G, Asthana A. Oral Methotrexate in split dose weekly versus oral or parenteral Methotrexate once weekly in Rheumatoid Arthritis: a short-term study. Int J Rheum Dis. 2016 Jul 26. doi: 10.1111/1756-185X.12910. [Epub ahead of print]. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27455886
23. Bianchi G, Caporali R, Todoerti M, Mattana P. Methotrexate and Rheumatoid Arthritis: Current Evidence Regarding Subcutaneous Versus Oral Routes of Administration. Adv Ther. 2016 Mar;33(3):369-78. doi: 10.1007/s12325-016-0295-8. Epub 2016 Feb 4.Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4833794/
24. Conway R, Low C, Coughlan RJ, O’Donnell MJ, Carey JJ. Leflunomide Use and Risk of Lung Disease in Rheumatoid Arthritis: A Systematic Literature Review and Meta-analysis of Randomized Controlled Trials. J Rheumatol. 2016 May;43(5):855-60. doi: 10.3899/jrheum.150674. Epub 2016 Mar 15. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26980577
25. Manathip Osiri , Beverley Shea , Vivian Welch , Maria E Suarez-Almazor , Vibeke Strand , Peter Tugwell and George A Wells. Leflunomide for the treatment of rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: July 2002.
Assessed as up-to-date: 19 July 2009. DOI: 10.1002/14651858.CD002047.  Available from:  http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD002047/full
26. Maria E Suarez-Almazor,  Elaine Belseck,  Beverley Shea,  Peter Tugwell,  George A Wells.
Cyclophosphamide for treating rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews. Assessed as up-to-date: 29 August 2000  DOI: 10.1002/14651858.CD001157.  Available from:  http://onlinelibrary. wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD001157/full
17. Singh J.A. et al. 2015 American College of Rheumatology Guideline for the Treatment of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Care & Research;  DOI 10.1002/acr.22783 VC 2015, American College of Rheumatology. Available from: http://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/ACR%202015%20RA%20Guideline.pdf
18. Rheumatoid arthritis in adults: management NICE guidelines [CG-79] Published date: February 2009. Last updated: December 2015. Available from: https://www.nice.org.uk/guidance/cg79/resources/rheumatoid-arthritis-in-adults-management-975636823525
19. Management of early rheumatoid arthritis. (SIGN Guideline No 123). Available from:  http://www.sign.ac.uk/pdf/sign123.pdf
28. John R Kirwan , Johannes WJ Bijlsma , Maarten Boers and Beverley Shea. Effects of glucocorticoids on radiological progression in rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: January 2007. DOI: 10.1002/14651858.CD006356. Available from:  http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD006356/full
29. Lindsey Criswell , Kenneth Saag , K M Sems , Vivian Welch , Beverley Shea , George A Wells and Maria E Suarez-Almazor. Moderate-term, low-dose corticosteroids for rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews.Online Publication Date: July 1998. DOI: 10.1002/14651858.CD001158. Available from:  http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD001158/full
17. Singh J.A. et al. 2015 American College of Rheumatology Guideline for the Treatment of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Care & Research;  DOI 10.1002/acr.22783 VC 2015, American College of Rheumatology. Available from: http://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/ACR%202015%20RA%20Guideline.pdf
18. Rheumatoid arthritis in adults: management NICE guidelines [CG-79] Published date: February 2009. Last updated: December 2015. Available from: https://www.nice.org.uk/guidance/cg79/resources/rheumatoid-arthritis-in-adults-management-975636823525
19. Management of early rheumatoid arthritis. (SIGN Guideline No 123). Available from:  http://www.sign.ac.uk/pdf/sign123.pdf
28. John R Kirwan , Johannes WJ Bijlsma , Maarten Boers and Beverley Shea. Effects of glucocorticoids on radiological progression in rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: January 2007. DOI: 10.1002/14651858.CD006356. Available from:  http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD006356/full
29. Lindsey Criswell , Kenneth Saag , K M Sems , Vivian Welch , Beverley Shea , George A Wells and Maria E Suarez-Almazor. Moderate-term, low-dose corticosteroids for rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews.Online Publication Date: July 1998. DOI: 10.1002/14651858.CD001158. Available from:  http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD001158/full
18. Rheumatoid arthritis in adults: management NICE guidelines [CG-79] Published date: February 2009. Last updated: December 2015. Available from: https://www. nice.org.uk/guidance/cg79/resources/rheumatoid-arthritis-in-adults-management-975636823525
19. Management of early rheumatoid arthritis. (SIGN Guideline No 123). Available from:  http://www.sign.ac.uk/pdf/sign123.pdf
 30. Atzeni F , Monguzzi A , Grillo E , Lanata L and Sarzi-Puttini P. Efficacy of ketoprofen vs ibuprofen and diclofenac for treating pain in patients with rheumatoid arthritis : A systematic review and meta-analysis. Arthritis and Rheumatology, 2014, 66, S1062
18. Rheumatoid arthritis in adults: management NICE guidelines [CG-79] Published date: February 2009. Last updated: December 2015. Available from: https://www.nice.org.uk/guidance/cg79/resources/rheumatoid-arthritis-in-adults-management-975636823525
19. Management of early rheumatoid arthritis. (SIGN Guideline No 123). Available from:  http://www.sign.ac.uk/pdf/sign123.pdf                                                                             31. Chen Y F , Jobanputra P , Barton P , Bryan S , Fry-Smith A , Harris G and Taylor R S. Cyclooxygenase-2 selective non-steroidal anti-inflammatory drugs (etodolac, meloxicam , celecoxib, rofecoxib, etoricoxib, valdecoxib and lumiracoxib) for osteoarthritis and rheumatoid arthritis : a systematic review and economic evaluation (Structured abstract) . Centre for Reviews and Dissemination. Health Technology Assessment, 2008, 12(11), 1-178. Available from:   http://onlinelibrary.wiley.com/o/cochrane/cldare/articles/DARE-12008104813/frame.html
18. Rheumatoid arthritis in adults: management NICE guidelines [CG-79] Published date: February 2009. Last updated: December 2015. Available from: https://www.nice.org.uk/guidance/cg79/resources/rheumatoid-arthritis-in-adults-management-975636823525
19. Management of early rheumatoid arthritis. (SIGN Guideline No 123). Available from:  http://www.sign.ac.uk/pdf/sign123.pdf
32. Shi W, Wang YM, Cheng NN, Chen BY, Li D.  Meta-analysis on the effect and adverse reaction on patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritistreated with non-steroidal anti-inflammatory drugs. [Article in Chinese].   Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2003 Nov;24(11):1044-8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14687510
18. Rheumatoid arthritis in adults: management NICE guidelines [CG-79] Published date: February 2009. Last updated: December 2015. Available from: https://www.nice.org.uk/guidance/cg79/resources/rheumatoid-arthritis-in-adults-management-975636823525
19. Management of early rheumatoid arthritis. (SIGN Guideline No 123). Available from:  http://www.sign.ac.uk/pdf/sign123.pdf
32. Shi W, Wang YM, Cheng NN, Chen BY, Li D.  Meta-analysis on the effect and adverse reaction on patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritistreated with non-steroidal anti-inflammatory drugs. [Article in Chinese].   Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2003 Nov;24(11):1044-8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14687510
18. Rheumatoid arthritis in adults: management NICE guidelines [CG-79] Published date: February 2009. Last updated: December 2015. Available from: https://www.nice.org.uk/guidance/cg79/resources/rheumatoid-arthritis-in-adults-management-975636823525
19. Management of early rheumatoid arthritis. (SIGN Guideline No 123). Available from:  http://www.sign.ac.uk/pdf/sign123.pdf
35. Alexandra N Colebatch , Jonathan L Marks and Christopher J Edwards. Safety of non-steroidal anti-inflammatory drugs, including aspirin and paracetamol (acetaminophen) in people receiving methotrexate for inflammatory arthritis (rheumatoid arthritis , ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis , other spondyloarthritis). Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: November 2011. DOI: 10.1002/14651858.CD008872.pub2. Available from:   http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD008872.pub2/full
 36. Jonathan L Marks , Alexandra N Colebatch , Rachelle Buchbinder and Christopher J Edwards. Pain management for rheumatoid arthritis and cardiovascular or renal comorbidity. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: October 2011. DOI: 10.1002/14651858.CD008952.pub2 Available from:   http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD008952.pub2/full
18. Rheumatoid arthritis in adults: management NICE guidelines [CG-79] Published date: February 2009. Last updated: December 2015. Available from: https://www.nice.org.uk/guidance/cg79/resources/rheumatoid-arthritis-in-adults-management-975636823525
19. Management of early rheumatoid arthritis. (SIGN Guideline No 123). Available from:  http://www.sign.ac.uk/pdf/sign123.pdf
37. Martín-Mola E, Gijón-Baños J, Ansoleaga JJ.Aceclofenac in comparison to ketoprofen in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatol Int. 1995;15(3):111-6. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8588120
18. Rheumatoid arthritis in adults: management NICE guidelines [CG-79] Published date: February 2009. Last updated: December 2015. Available from: https://www.nice.org.uk/guidance/cg79/resources/rheumatoid-arthritis-in-adults-management-975636823525
19. Management of early rheumatoid arthritis. (SIGN Guideline No 123). Available from:  http://www.sign.ac.uk/pdf/sign123.pdf
31. Chen Y F , Jobanputra P , Barton P , Bryan S , Fry-Smith A , Harris G and Taylor R S. Cyclooxygenase-2 selective non-steroidal anti-inflammatory drugs (etodolac, meloxicam , celecoxib, rofecoxib, etoricoxib, valdecoxib and lumiracoxib) for osteoarthritis and rheumatoid arthritis : a systematic review and economic evaluation (Structured abstract) . Centre for Reviews and Dissemination. Health Technology Assessment, 2008, 12(11), 1-178. Available from:   http://onlinelibrary.wiley.com/o/cochrane/cldare/articles/DARE-12008104813/frame.html
17. Singh J.A. et al. 2015 American College of Rheumatology Guideline for the Treatment of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Care & Research;  DOI 10.1002/acr.22783 VC 2015, American College of Rheumatology. Available from: http://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/ACR%202015%20RA%20Guideline.pdf
20. Josef S. Smolen et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2013 update. Ann Rheum Dis. doi: 10.1136/annrheumdis-2013-204573. Available from:  http://ard.bmj.com/content/early/2013/10/23/annrheumdis-2013-204573.full       38. Navarro-Millán I, Singh JA, Curtis JR.  Systematic review of tocilizumab for rheumatoid arthritis: a new biologic agent targeting the interleukin-6 receptor. Clin Ther. 2012 Apr;34(4):788-802.e3. doi: 10.1016/j.clinthera.2012.02.014. Epub 2012 Mar 22. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3805022/
39. Jasvinder A Singh , Saba Beg and Maria Angeles Lopez-Olivo. Tocilizumab for rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: July 2010. DOI: 10.1002/14651858.CD008331.pub2. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD008331.pub2/full
17. Singh J.A. et al. 2015 American College of Rheumatology Guideline for the Treatment of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Care & Research;  DOI 10.1002/acr.22783 VC 2015, American College of Rheumatology. Available from: http://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/ACR%202015%20RA%20Guideline.pdf
20. Josef S. Smolen et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2013 update. Ann Rheum Dis. doi: 10.1136/annrheumdis-2013-204573. Available from:  http://ard.bmj.com/content/early/2013/10/23/annrheumdis-2013-204573.full       40. Maria Angeles Lopez-Olivo , Matxalen Amezaga Urruela , Lynda McGahan , Eduardo N Pollono and Maria E Suarez-Almazor. Rituximab for rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: January 2015. DOI: 10.1002/14651858.CD007356.pub2. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD007356.pub2/full
17. Singh J.A. et al. 2015 American College of Rheumatology Guideline for the Treatment of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Care & Research;  DOI 10. 1002/acr.22783 VC 2015, American College of Rheumatology. Available from: http://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/ACR%202015%20RA%20Guideline.pdf
20. Josef S. Smolen et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2013 update. Ann Rheum Dis. doi: 10.1136/annrheumdis-2013-204573. Available from:  http://ard.bmj.com/content/early/2013/10/23/annrheumdis-2013-204573.full        41. Barbara BTB Blumenauer , Maria Judd , George A Wells   et al. Infliximab for the treatment of rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: July 2002. DOI: 10.1002/14651858.CD003785. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD003785/full
42. Jasvinder A Singh , Robin Christensen , George A Wells et al. Biologics for rheumatoid arthritis : an overview of Cochrane reviews. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: October 2009. DOI: 10.1002/14651858.CD007848.pub2. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD007848.pub2/full
69. Yoo DH , Racewicz A , Brzezicki J , Yatsyshyn R , Arteaga ET , Baranauskaite A , Abud-Mendoza C , Navarra S , Kadinov V , Sariego IG , Hong SS , Lee SY and Park W.
A phase III randomized study to evaluate the efficacy and safety of CT-P13 compared with reference infliximab in patients with active rheumatoid arthritis : 54-week results from the PLANETRA study. Arthritis research & therapy, 2016, 18(1):82-94 . Available from:   https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4818886/pdf/13075_2016_Article_981.pdf .
70.Takeuchi T , Yamanaka H , Tanaka Y , Sakurai T , Saito K , Ohtsubo H , Lee SJ and Nambu Y. Evaluation of the pharmacokinetic equivalence and 54-week efficacy and safety of CT-P13 and innovator infliximab in Japanese patients with rheumatoid arthritis . Modern Rheumatology, 2015, 25(6 // *AstraZeneca*), 817. Available from:   https://www. ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4732515/

17. Singh J.A. et al. 2015 American College of Rheumatology Guideline for the Treatment of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Care & Research;  DOI 10.1002/acr.22783 VC 2015, American College of Rheumatology. Available from: http://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/ACR%202015%20RA%20Guideline.pdf
20. Josef S. Smolen et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2013 update. Ann Rheum Dis. doi: 10.1136/annrheumdis-2013-204573. Available from:  http://ard.bmj.com/content/early/2013/10/23/annrheumdis-2013-204573.full       43. Anne Lethaby , Maria Angeles Lopez-Olivo , Lara J Maxwell , Amanda Burls , Peter Tugwell and George A Wells. Etanercept for the treatment of rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: May 2013. DOI: 10.1002/14651858.CD004525.pub2.  Available from: http://onlinelibrary.wiley. com/doi/10.1002/14651858.CD004525.pub2/full
17. Singh J.A. et al. 2015 American College of Rheumatology Guideline for the Treatment of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Care & Research;  DOI 10.1002/acr.22783 VC 2015, American College of Rheumatology. Available from: http://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/ACR%202015%20RA%20Guideline.pdf
20. Josef S. Smolen et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2013 update. Ann Rheum Dis. doi: 10.1136/annrheumdis-2013-204573. Available from:  http://ard.bmj.com/content/early/2013/10/23/annrheumdis-2013-204573.full       44. Federico Navarro-Sarabia , Rafael Ariza-Ariza , Blanca Hernandez-Cruz and Isidro Villanueva. Adalimumab for treating rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: July 2005. DOI: 10.1002/14651858.CD005113.pub2. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858. CD005113.pub2/full
17. Singh J.A. et al. 2015 American College of Rheumatology Guideline for the Treatment of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Care & Research;  DOI 10.1002/acr.22783 VC 2015, American College of Rheumatology. Available from: http://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/ACR%202015%20RA%20Guideline.pdf
20. Josef S. Smolen et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2013 update. Ann Rheum Dis. doi: 10.1136/annrheumdis-2013-204573. Available from:  http://ard.bmj.com/content/early/2013/10/23/annrheumdis-2013-204573.full       5. Jasvinder A Singh , Shahrzad Noorbaloochi and Gurkirpal Singh. Golimumab  for rheumatoid  arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Online Publication Date: January 2010. DOI: 10.1002/14651858.CD008341. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD008341/full
18. Rheumatoid arthritis in adults: management NICE guidelines [CG-79] Published date: February 2009. Last updated: December 2015. Available from:
 https://www.nice.org.uk/guidance/cg79/resources/rheumatoid-arthritis-in-adults-management-975636823525
19. Management of early rheumatoid arthritis. (SIGN Guideline No 123). Available from:  http://www.sign.ac.uk/pdf/sign123.pdf
46. Jonathan L Marks , Alexandra N Colebatch , Rachelle Buchbinder and Christopher J Edwards. Pain management for rheumatoid arthritis and cardiovascular or renal comorbidity. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: October 2011 DOI: 10.1002/14651858.CD008952.pub2.
Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD008952.pub2/full
47. Samuel L Whittle , Bethan L Richards , Elaine Husni and Rachelle Buchbinder. Opioid therapy for treating rheumatoid arthritis pain. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: November 2011. DOI: 10.1002/14651858.CD003113.pub3
Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD003113. pub3/full
48. Bekiarova P , Gerginova V and Sheitanov I. Clinical evaluation of the drug Mydocalm (“gedeon richter”) in patients with ankylosing spondylitis and spondyloarthrosis. [Bulgarian]
Revmatologiia (Moscow, Russia), 2000, 8(4), 41
53. Gaffney A, Gaffney P. Rheumatoid arthritis and heparin. Br J Rheumatol. 1996 Aug;35(8):808-9. Available from: http://rheumatology.oxfordjournals.org/content/35/8/808.long
54. H A E M van Heereveld, R Laan, F H J van den Hoogen, M Malefijt, I Novakova, and L B A van de Putte. Prevention of symptomatic thrombosis with short term (low molecular weight) heparin in patients with rheumatoid arthritis after hip or knee replacement. Ann Rheum Dis. 2001 Oct; 60(10): 974–976. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1753387/
54. H A E M van Heereveld, R Laan, F H J van den Hoogen, M Malefijt, I Novakova, and L B A van de Putte. Prevention of symptomatic thrombosis with short term (low molecular weight) heparin in patients with rheumatoid arthritis after hip or knee replacement. Ann Rheum Dis. 2001 Oct; 60(10): 974–976. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1753387/
49. Forrest CM, Stoy N, Stone TW, Harman G, Mackay GM, Oxford L, Darlington LG. Adenosine  and  cytokine levels following treatment of rheumatoid arthritis with dipyridamole. Rheumatol Int. 2006 Nov;27(1):11-7. Epub 2006 Sep 20. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17021714
50. Usha PR , Naidu MUR and Datla R.  Clinical efficacy and tolerability evaluation of pentoxifylline in  rheumatoid arthritis : A double-blind, randomised, placebo-controlled study. Clinical drug investigation, 2002, 22(5), 329. Available from: http://link.springer.com/article/10.2165/00044011-200222050-00007
18. Rheumatoid arthritis in adults: management NICE guidelines [CG-79] Published date: February 2009. Last updated: December 2015. Available from:
 https://www.nice.org.uk/guidance/cg79/resources/rheumatoid-arthritis-in-adults-management-975636823525
51. Chen Y F , Jobanputra P , Barton P , Bryan S , Fry-Smith A , Harris G and Taylor R S. Cyclooxygenase-2 selective non-steroidal anti-inflammatory drugs (etodolac, meloxicam, celecoxib, rofecoxib, etoricoxib, valdecoxib and lumiracoxib) for osteoarthritis and rheumatoid arthritis : a systematic review and economic evaluation (Structured abstract).Centre for Reviews and Dissemination. Health Technology Assessment, 2008, 12(11), 1-178. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18405470
52. tenWolde S , Dijkmans BA , Janssen M , Hermans J and Lamers CB. High-dose ranitidine for the prevention of recurrent peptic ulcer disease in rheumatoid arthritis patients taking NSAIDs. Alimentary pharmacology & therapeutics, 1996, 10(3), 347.  Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8791962
57. Borrás-Blasco J, Nuñez-Cornejo C, Gracia-Perez A, Rosique-Robles JD, Casterá MD, Viosca E, Abad FJ. Parapharyngeal abscess in a patient receiving etanercept. Ann Pharmacother. 2007 Feb;41(2):341-4. Epub 2007 Jan 16. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17227824
58. Corrao G, Zambon A, Bertù L, Mauri A, Paleari V, Rossi C, Venegoni M. Evidence of tendinitis provoked by fluoroquinolone treatment: a case-control study. Drug Saf. 2006;29(10):889-96. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16970512/
55. Caperton EM , Heim-Duthoy KL , Matzke GR , Peterson PK and Johnson RC. Ceftriaxone therapy of chronic inflammatory arthritis . A double-blind placebo controlled trial. Archives of internal medicine, 1990, 150(8), 1677.  Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2383162   
60. Marshall DA , Hunter JA and Capell HA. Double blind, placebo controlled study of metronidazole as a disease modifying agent in the treatment of rheumatoid arthritis. Annals of the rheumatic diseases, 1992, 51(6), 758. Available from:  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1616359
59. Al-Kaissi E and Al-Muhtaseb N. The influence of adding antibiotic in treatment of rheumatoid arthritis patients on Streptococcus pyogenes carrier rate and on the lipids profile. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2015, 7(2), 245. Available from: http://innovareacademics.in/journals/index.php/ijpps/article/view/3916
61. Mowla K , Rajai E , Ghorbani A , Dargahi-Malamir M , Bahadoram M and Mohammadi S. Effect of atorvastatin on the disease activity and severity of rheumatoid arthritis : Double-blind randomized controlled trial. Journal of Clinical and Diagnostic Research, 2016, 10(5), OC32. Available from:  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27437268
62. McCarey DW , McInnes IB , Madhok R , Hampson R , Scherbakov O , Ford I , Capell HA and Sattar N. Trial of Atorvastatin in Rheumatoid Arthritis (TARA): double-blind, randomised placebo-controlled trial. Lancet (London, England), 2004, 363(9426), 2015. Available from:  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15207950
63. Mikhael EM , Gorial FI and Majeed IA. Effect of rosuvastatin as adjuvant therapy to methotrexate on hematological parameters in patients with moderately-highly active rheumatoid arthritis. Journal of Experimental and Integrative Medicine, 2013, 3(2), 127. Available from:  http://www.scopemed.org/?mno=32513
64. Kumar P , Kennedy G , Khan F , Pullar T and Belch JJF. Rosuvastatin might have an effect on C-reactive protein but not on rheumatoid disease activity: Tayside randomized controlled study. Scottish Medical Journal, 2012, 57(2), 80. Available from:   http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22555227
65. Beverley Shea , Michael V Swinden , Elizabeth Tanjong Ghogomu , Zulma Ortiz , Wanruchada Katchamart, Tamara Rader , Claire Bombardier , George A Wells and Peter Tugwell.  Folic acid and folinic acid  for reducing side effects in patients receiving methotrexate for rheumatoid arthritis. Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: May 2013. DOI: 10.1002/14651858.CD000951.pub2. Available from:   http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD000951.pub2/full
66.Chiang EP , Selhub J , Bagley PJ , Dallal G and Roubenoff R. Pyridoxine supplementation corrects vitamin B6 deficiency but does not improve inflammation in patients withrheumatoid arthritis . Arthritis research & therapy, 2005, 7(6), R1404. Available from:   http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16277693
67.Hamilton SF , Campbell NR , Kara M , Watson J and Connors M. The effect of ingestion of ferrous sulfate on the absorption of oral methotrexate in patients with rheumatoid arthritis. The Journal of rheumatology, 2003, 30(9), 1948. Available from:   http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12966595
68. Sofia Ramiro , Helga Radner , Désirée van der Heijde , Astrid van Tubergen , Rachelle Buchbinder , Daniel Aletaha and Robert BM Landewé. Combination therapy for pain management in inflammatory  arthritis (rheumatoid arthritis , ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis , other spondyloarthritis). Cochrane Database of Systematic Reviews. Online Publication Date: October 2011. Available from:   http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD008886.pub2/full 

Лечение мочекаменной болезни | Клиника китайской медицины ТАО

Мочекаменная болезнь – довольно часто встречаемое заболевание.

Сейчас в мире насчитывается порядка 40% пациентов, страдающих данным недугом. Особенно часто этот диагноз ставится пациентам старше 65 лет (мужчинам в 3 раза чаще, чем женщинам).

Физиологически данное заболевание представляет собой нарушение обмена веществ, что в итоге и приводит к возникновению камней в почках, мочеточниках, мочевом пузыре. Двигаясь вниз по мочеточникам, камни рано или поздно блокируют выход продуктов распада, вызывая все новые и новые мучения.

Боль, возникающая при данном заболевании, настолько мучительна, что не всегда снимается «типичными» анальгетиками: иногда болевой синдром купируется посредством препаратов группы морфина (наркотические вещества).

Чтобы ощутить хотя бы толику того, что может испытывать пациент, страдающий мочекаменной болезнью, достаточно взять небольшой камень, имеющий острые края и провести им по слизистой оболочке ротовой полости. Даже без особого нажима вы ощутите сильную, мучительную боль.

Слизистая мочевыводящих путей, ткани, выстилающая почечные лоханки гораздо нежней и чувствительней ротовой полости. Поэтому те, кто столкнется с мочекаменной болезнью, стремится избавить себя от мучительной, изматывающей, ни на секунду не прекращающейся боли. А если это касается самых близких людей, боль которых мы воспринимаем, как свою? Вопрос риторический.

Читать полностью

Мочекаменная болезнь

Причины заболевания

Для лучшего понимания механизмов лечения мочекаменной болезни, остановимся на причинах заболевания. В их основе лежит нарушение обмена веществ. Различают нарушение обмена пуринов и белкового обмена, соответственно, природа камней также будет отличаться. К факторам возникновения заболевания относят: застой циркуляции крови в области малого таза, несбалансированное питание, хронические заболевания мочеполовой сферы (простатит, цистит, аденома простаты), а также снижение защитных сил организма.

Одной из причин возникновения мочекаменной болезни являются хронические заболевания пищеварительной системы.

Лечение мочекаменной болезни в клинике «ТАО»

Очень важно при постановке диагноза «мочекаменная болезнь», приступить к своевременному лечению данного заболевания. Для этого достаточно сделать 3 основных шага:

  • Купировать болевой синдром (избавить пациента от боли).
  • Снять воспалительный процесс.
  • Предотвратить дальнейшее течение заболевания.

Возможен радикальный путь решения данного вопроса. Чтобы снять невыносимую, не позволяющую ни о чем думать, боль, Вам можно употребить ни один десяток «сильных» препаратов, каждый из которых способен за короткое время разрушить ткани печени, почек, вызвать хронические заболевания желудочно-кишечного тракта. Но со своей «основной задачей» любой из анальгетиков справится – боль уйдет, пусть и на короткое время.

Удалить камни из мочевого пузыря, мочеточников, почек можно и оперативным (хирургическим) путем. При этом возможны следующие негативные последствия:

  • Непеносимость наркоза.
  • Возможные осложнения во время оперативного вмешательства.
  • Риск остановки сердца и дыхания.
  • Сложный послеоперационный период.

Выше перечислены лишь основные, лежащие на поверхности возможные негативные последствия, которые Вас ожидают.

Второй путь лечения мочекаменной болезни – это литотрипсия – дробление камней силой ударной волны, частотой 200-400 уд./мин. Данный метод не столь безопасен и эффективен, ведь сила ударной волны оказывает негативное воздействие и на здоровые ткани. Кроме того, он имеет много противопоказаний.

Возвращение к природным, щадящим, эффективным, «понимающим» природу заболевания, работу всех систем организма и соответствующим основному принципу медицины «Не навреди» методам диагностики и лечения – это основа, которой придерживаются специалисты клиники «ТАО».

Ведь, идя против природы человека, борясь лишь с одним заболеваниям, напрочь забывая о том, что организм – это единая равновесная система, мы не боремся с болезнью, а лишь усугубляем ее течение.

Методы лечения мочекаменной болезни в нашей клинике заключаются в:

  • комплексной рефлексотерапии,
  • фитотерапии,
  • диетотерапии.

Штат клиники «ТАО» укомплектован исключительно специалистами из «Поднебесной», которые помимо знаний современной медицины владеют уникальными методиками китайской медицины, знания и умения при этом часто передаются из поколения в поколение и содержатся в строжайшем секрете.

Рефлексотерапия заключается в воздействии на точки, расположенные на теле человека. Даже 2-3 воздействия на «правильные точки» буквально заставляют работать больной орган, включают силы самоизлечения, восстановления организма. Уже после первого сеанса рефлексотерапии пациенты, страдающие мочекаменной болезнью, отмечают, что исчезает боль.

Специалист работает со всеми зонами, отвечающими за данное заболевание, а именно:

  • Сань Инь Цзяо
  • Тай Чун
  • Ян Лин Цюань
  • Ин Лин Цюань
  • Шэнь Шу и так далее.

Правильные воздействия на точки способствуют самовосстановлению тканей мочеполовой системы, «изгнание», борьбу с «контрагентом», которым в данном случае является камень.

Средства фитотерапии – уникальные, сбалансированные, ищущие к нам из глубины веков растительные комплексы снимают воспалительный процесс, устраняют болевые ощущения, способствуют восстановлению поврежденных клеток и их быстрому обновлению.

Диетотерапия является вспомогательной, но немаловажной частью комплексного лечения мочекаменной болезни. Она помогает восстановить организм, стимулирует иммунную систему, является своего рода поддерживающей терапией, одним из этапов профилактики дальнейшего рецидива (возвращения) заболевания.

Но самое главное, что обеспечивают методы китайской медицины при борьбе с мочекаменной болезнью – это безопасность лечения. Полностью исключены осложнения, методы китайской медицины неинвазивны (безоперационны) и бескровны, щадящи, а методики направлены на поиск индивидуального подхода к каждому пациенту.

Кроме того, помимо основного заболевания, часто возможно улучшение общего состояния организма, избавление от других видов заболеваний, например, повышение потенции.

На всех этапах лечения мы стараемся добиться максимального эффекта.

Симптомы заболевания

Основными симптомами заболевания является тянущая боль в области поясницы, она может носить как периодический, так и постоянный характер. Основной коварство болезни заключается в том, что часто заболевание проходит полностью бессимптомно, а в один «прекрасный день» Вы просыпаетесь от невыносимой острой боли, которая практически не купируется ни одним из препаратов домашней аптечки. Иногда боль возникает при интенсивной физической нагрузке, во время пребывания в транспорте (вследствие тряски) и т.д.

В том случае, если камень достаточно небольшой, он перемещается, и тогда возникает боль в паховой области, частые позывы к мочеиспусканию, затрудненность мочеиспускания.

Возникает озноб, повышается температура тела, тошнота, которая нередко сопровождается рвотой, вздутие и напряжение мышц передней брюшной стенки.

Диагностика

Диагноз «мочекаменная болезнь» ставится на основе жалоб пациента, результата УЗИ, рентгенологического исследования, лабораторной диагностики (анализа крови, мочи) и т.д. Крайне важно для правильного лечения установить химическую природу камней, чтобы, во-первых, исключить употребление продуктов, способствующих накоплению данных компонентов, а, во-вторых, разработать правильную тактику дальнейшего лечения. В случае подозрения на нахождение камня в мочевом пузыре, проводится цистоскопия.

Специалисты китайской медицины являются приверженцами строго индивидуального подхода к каждому пациенту. Они создают такие условия, что организм сам мобилизует все силы на борьбу с заболеванием.

Профилактика мочекаменной болезни

Профилактика заболевания заключается в контроле нарушения обмена веществ. Этому способствует как сбалансированное питание, так и возможный прием фитопрепаратов, который Вам помогут подобрать специалисты нашей клиники. В их состав входят травы и лекарственные компоненты, насыщенные кальцием (по показаниям), витамина С, ортофосфатов (по показаниям), клетчатки, магния и т.д. Все перечисленные выше компоненты являются отличной профилактикой заболевания. Кроме того, необходимо увеличить употребление жидкости (до 2 литров в сутки) и, наоборот, ограничение употребления животного белка, соли, щавелевой кислоты.

Самостоятельно подобрать комплекс профилактических мер достаточно сложно. Важно многое учесть: «природу камня», тип питания, особенности работы и даже наличие или отсутствие лишнего веса.

Для того, чтобы как можно скорее забыть о заболевании, не нужно заниматься самолечением или пытаться испытать на себе «возможности» современной классической медицины. Природа нашего организма мудра: его возможности безграничны и при правильном подходе всегда открыты.

HtrA2 подавляет аутоиммунный артрит и регулирует активацию STAT3. Rheumatology international 32, 2731–2736, doi: 10.1007/s00296-011-1984-x (2012).

КАС Статья пабмед Google ученый

  • ван Гамбург, Дж. П. и др. Клетки Th27, но не клетки Th2, у пациентов с ранним ревматоидным артритом являются мощными индукторами матриксных металлопротеиназ и провоспалительных цитокинов при взаимодействии синовиальных фибробластов, включая продукцию аутокринного интерлейкина-17А. Arthritis Rheum 63, 73–83, doi: 10.1002/art.30093 (2011).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Смолен Ю.С. и др. Провоспалительные цитокины при ревматоидном артрите: патогенетические и терапевтические аспекты. Клинические обзоры по аллергии и иммунологии 28, 239–248, doi: 10.1385/CRIAI:28:3:239 (2005).

    КАС Статья Google ученый

  • Циолковская, М.и другие. Высокие уровни IL-17 у пациентов с ревматоидным артритом: IL-15 запускает продукцию in vitro IL-17 через чувствительный к циклоспорину А механизм. Журнал иммунологии 164, 2832–2838 (2000).

    КАС Статья Google ученый

  • Чо М.Л. и др. Сигнальный путь STAT3 и NF-kappaB необходим для опосредованной IL-23 продукции IL-17 у мышей с дефицитом антагониста рецептора IL-1 в модели спонтанного артрита. Журнал иммунологии 176, 5652–5661 (2006).

    КАС Статья Google ученый

  • Матхур, А. Н. и др. Stat3 и Stat4 направляют развитие секретирующих IL-17 Th-клеток. Журнал иммунологии 178, 4901–4907 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Yang, X. O. et al. STAT3 регулирует опосредованную цитокинами генерацию воспалительных хелперных Т-клеток. Журнал биологической химии 282, 9358–9363, doi: 10.1074/jbc.C600321200 (2007 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • O’Shea, J.J. & Paul, W.E. Механизмы, лежащие в основе приверженности линии и пластичности вспомогательных CD4+ T-клеток. Science 327, 1098–1102, doi: 10.1126/science.1178334 (2010).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Son, H.J. et al.Метформин ослабляет экспериментальный аутоиммунный артрит посредством реципрокной регуляции баланса Th27/Treg и остеокластогенеза. Медиаторы воспаления 2014, 973986, doi: 10.1155/2014/973986 (2014).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Park, J. S. et al. STA-21, многообещающий ингибитор STAT-3, который реципрокно регулирует клетки Th27 и Treg, ингибирует остеокластогенез у мышей и людей и облегчает аутоиммунное воспаление в экспериментальной модели ревматоидного артрита.Артрит и ревматология 66, 918–929, doi: 10.1002/art.38305 (2014).

    КАС Статья Google ученый

  • Праджапати Р., Плант Д. и Бартон А. Генетические и геномные предикторы реакции анти-ФНО. Pharmacogenomics 12, 1571–1585, doi: 10.2217/pgs.11.114 (2011).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Hetland, M.L. et al. Прямое сравнение ответа на лечение, показателей ремиссии и приверженности лечению у пациентов с ревматоидным артритом, получавших адалимумаб, этанерцепт или инфликсимаб: результаты восьмилетнего наблюдения за клинической практикой в ​​общенациональном датском реестре DANBIO. Артрит и ревматизм 62, 22–32, doi: 10.1002/art.27227 (2010).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Паула, Ф. С. и Алвес, Дж. Д. Биологическая терапия ревматоидного артрита, не основанная на факторе некроза опухоли: настоящее, будущее и понимание патогенеза. Биологические препараты: мишени и терапия 8, 1–12, doi: 10.2147/BTT.S35475 (2014).

    КАС Статья Google ученый

  • Ванде Валле, Л., Lamkanfi, M. & Vandenabeele, P. Митохондриальная сериновая протеаза HtrA2/Omi: обзор. Гибель и дифференцировка клеток 15, 453–460, doi: 10.1038/sj.cdd.4402291 (2008).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Martins, L.M. et al. Нейропротекторная роль сериновой протеазы HtrA2/Omi, родственной Reaper, выявлена ​​путем целенаправленной делеции у мышей. Молекулярная и клеточная биология 24, 9848–9862, doi: 10. 1128/MCB.24.22.9848-9862.2004 (2004).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Rathke-Hartlieb, S. et al. Прогрессирующая потеря нейронов полосатого тела вызывает моторную дисфункцию у мышей с мутацией MND2 и не предотвращается Bcl-2. Экспериментальная неврология 175, 87–97, doi: 10.1006/exnr.2002.7868 (2002).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Оливейра, Р.Д. и др. Дифференциальные профили генной экспрессии могут различать пациентов с ревматоидным артритом, отвечающих на лечение, и пациентов, не ответивших на лечение при монотерапии метотрексатом (МТ) и комбинированной терапии МТ плюс ингибитор фактора некроза опухоли. Журнал ревматологии 39, 1524–1532, doi: 10.3899/jrheum.120092 (2012).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Jones, J.M. et al. Потеря активности митохондриальной протеазы Omi вызывает нервно-мышечное расстройство у мышей с мутацией mnd2. Nature 425, 721–727, doi: 10.1038/nature02052 (2003).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья пабмед Google ученый

  • Кан, С. и др. Потеря активности HtrA2/Omi в ненейронных тканях взрослых мышей вызывает преждевременное старение. Гибель и дифференцировка клеток 20, 259–269, doi: 10.1038/cdd.2012.117 (2013).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Джонс, Дж.М. и др. mnd2: новая мышиная модель наследственного заболевания двигательных нейронов. Genomics 16, 669–677, doi: 10.1006/geno.1993.1246 (1993).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Кулкарни А.Б. и др. Нулевая мутация трансформирующего фактора роста бета 1 у мышей вызывает чрезмерную воспалительную реакцию и раннюю смерть. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 90, 770–774 (1993).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья Google ученый

  • Тао З. и другие. Путь JAK2/STAT3, опосредующий воспалительные реакции у крыс, вызванных тепловым ударом. Международный журнал клинической и экспериментальной патологии 8, 6732–6739 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • О, Х. М. и др. Белок STAT3 способствует выживанию Т-клеток и ингибирует выработку интерлейкина-2 посредством повышающей регуляции факторов транскрипции класса O Forkhead. Журнал биологической химии 286, 30888–30897, doi: 10.1074/jbc.M111.253500 (2011).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Сато, К. и др. Th27 функционирует как подгруппа остеокластогенных хелперных Т-клеток, которая связывает активацию Т-клеток и разрушение кости. Журнал экспериментальной медицины 203, 2673–2682, doi: 10.1084/jem.20061775 (2006).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Томсон Т. М. и др. Выявление на основе крови пациентов, не ответивших на терапию анти-ФНО при ревматоидном артрите. Медицинская геномика BMC 8, 26, doi: 10.1186/s12920-015-0100-6 (2015).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Nakashima, Y., Plump, A.S., Raines, E.W., Breslow, J.L. & Ross, R. У мышей с дефицитом ApoE развиваются поражения всех фаз атеросклероза по всему артериальному дереву. Артериосклероз и тромбоз: журнал сосудистой биологии / Американская кардиологическая ассоциация 14, 133–140 (1994).

    КАС Статья Google ученый

  • Reddick, R.L., Zhang, S.H. & Maeda, N. Атеросклероз у мышей, лишенных апо E. Оценка развития и прогрессирования поражения. Артериосклероз и тромбоз: журнал сосудистой биологии / Американская кардиологическая ассоциация 14, 141–147 (1994).

    КАС Статья Google ученый

  • Вей Л. , Лоуренс А., Elias, K.M. & O’Shea, J.J. IL-21 вырабатывается клетками Th27 и управляет выработкой IL-17 в зависимости от STAT3. Журнал биологической химии 282, 34605–34610, doi: 10.1074/jbc.M705100200 (2007).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Koenders, M.I., Joosten, L.A. & van den Berg, W.B. Потенциальные новые мишени в терапии артрита: интерлейкин (IL)-17 и его связь с фактором некроза опухоли и IL-1 при экспериментальном артрите.Анналы ревматических заболеваний 65 Suppl 3, iii29–33, doi: 10.1136/ard.2006.058529 (2006).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ван, Л. и др. IL-17 может способствовать росту опухоли через сигнальный путь IL-6-Stat3. Журнал экспериментальной медицины 206, 1457–1464, doi: 10.1084/jem.200

  • (2009).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Хван С. Ю. и др. IL-17 индуцирует продукцию IL-6 и IL-8 в синовиальных фибробластах ревматоидного артрита посредством NF-kappaB- и PI3-киназы/Akt-зависимых путей. Исследования и терапия артрита 6, R120–128, doi: 10.1186/ar1038 (2004).

    КАС Статья Google ученый

  • Чо М.Л. и др. IL-17 индуцирует продукцию IL-16 при ревматоидном артрите. Экспериментальная и молекулярная медицина 40, 237–245, doi: 10.3858/emm.2008.40.2.237 (2008).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья Google ученый

  • Ким К.В., Ким Х.Р., Ким Б.М., Чо М.Л. и Ли С.Х. Цитокины Th27 регулируют остеокластогенез при ревматоидном артрите. Американский журнал патологии 185, 3011–3024, doi: 10.1016/j.ajpath.2015.07.017 (2015).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Ньюкомб, округ Колумбияи другие. IL-13 регулирует секрецию Th27 IL-17A зависимым от IL-10 образом. Журнал иммунологии 188, 1027–1035, doi: 10.4049/jimmunol.1102216 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • de Vries, J. E. Роль IL-13 и его рецептора в аллергических и воспалительных реакциях. Журнал аллергии и клинической иммунологии 102, 165–169 (1998).

    КАС Статья Google ученый

  • Лейдлоу Б.J., Craft, J.E. & Kaech, S.M. Многогранная роль CD4(+) T-клеток в памяти CD8(+) T-клеток. Обзоры природы. Иммунология 16, 102–111, doi: 10.1038/nri.2015.10 (2016).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Gerberick, G.F., Cruse, L.W., Miller, C.M., Sikorski, E.E. & Ridder, G.M. Избирательная модуляция маркеров Т-клеточной памяти CD62L и CD44 на мышиных дренирующих лимфатических узлах после обработки аллергеном и раздражителем.Токсикология и прикладная фармакология 146, 1–10, doi: 10. 1006/taap.1997.8218 (1997).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Sprecher, D.L. et al. Сердечно-сосудистые особенности гомозиготной семейной гиперхолестеринемии: анализ 16 пациентов. Американский журнал кардиологии 54, 20–30 (1984).

    КАС Статья Google ученый

  • Куш, Дж.Дж. и др. Повышенный уровень интерлейкина-10 у больных ревматоидным артритом. Артрит и ревматизм 38, 96–104 (1995).

    КАС Статья Google ученый

  • Бхаттачарья, П. и др. GM-CSF: Иммуномодулирующий цитокин, который может подавлять аутоиммунитет. Цитокин 75, 261–271, doi: 10.1016/j.cyto.2015.05.030 (2015).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Бхаттачарья П.и другие. Двойная роль GM-CSF как провоспалительного и регуляторного цитокина: значение для иммунной терапии. Журнал исследований интерферонов и цитокинов: официальный журнал Международного общества исследований интерферонов и цитокинов 35, 585–599, doi: 10.1089/jir.2014.0149 (2015).

    КАС Статья Google ученый

  • Роуин, Дж. и др. Лечение гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором больного с миастеническим кризом: влияние на регуляторные Т-клетки.Мышцы и нервы 46, 449–453, doi: 10.1002/mus.23488 (2012).

    Артикул Google ученый

  • Campbell, I.K. et al. Защита от индуцированного коллагеном артрита у мышей с дефицитом гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. Журнал иммунологии 161, 3639–3644 (1998).

    КАС Google ученый

  • Фарук, С. М., Кумар, А. и Ашур, Х. М. Опосредованная глазами иммунная толерантность к коллагену типа II у предрасположенных к артриту линий мышей. Журнал клеточной и молекулярной медицины 18, 2512–2518, doi: 10.1111/jcmm.12376 (2014).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Farooq, S.M. & Ashour, H.M. Коллаген типа II индуцирует периферическую толерантность у мышей BALB/c посредством образования CD8+ Т-регуляторных клеток. PloS one 7, e48635, doi: 10.1371/journal.pone.0048635 (2012).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Хён-А, С.и другие. Простой и точный анализ генотипа мышей с дегенерацией двигательных нейронов 2 (mnd2): простое руководство и стандартный протокол, применимый к моделям мутантных мышей. IBC 4, 8, doi: 10.4051/ibc.2012.4.3.0008 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • Уильямс, Р. О., Фельдманн, М. и Майни, Р. Н. Фактор некроза опухоли облегчает заболевание суставов при артрите, вызванном коллагеном у мышей. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 89, 9784–9788 (1992).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья Google ученый

  • Набор ревматологических проявлений у пациентов с дефицитом GATA2

    В ходе ретроспективного обзора 157 пациентов, выявленных в NIH, мы выявили 28 пациентов (17,8% нашей когорты дефицита GATA2) с ревматологическими проявлениями. Ревматологические проявления и проявления дефицита GATA2 обобщены в дополнительной таблице 1. Наиболее заметные охарактеризованные ревматологические признаки включали: пьезогенные папулы стопы (PPP), остеоартрит с ранним началом, анкилозирующий спондилит и серонегативный эрозивный ревматоидный артрит.Из пациентов с проявлениями ревматологического заболевания 22 (79%) сообщили о появлении симптомов до или в связи с молекулярной диагностикой дефицита GATA2. У некоторых пациентов были множественные ревматологические проявления, как указано в дополнительной таблице 1. Ревматологические проявления, подобные описанным в предыдущих публикациях, включали узловатую эритему (n = 3), панникулит без фоновой нетуберкулезной микобактериальной инфекции (n = 7), гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (n = 1), первичный билиарный цирроз (n = 1) и артралгии (n = 16). Ранее незарегистрированные находки: ППП (n = 6), анкилозирующий спондилит (n = 1), серонегативный эрозивный ревматоидный артрит (n = 1), псориаз (n = 4), псориатический артрит (n = 1), положительный результат на волчаночный антикоагулянт с невынашивание беременности в анамнезе (n = 1), рецидивирующий перикардит/серозит (n = 1), болезнь Бехчета (n = 1), симптомы сухости (n = 1), ретикулярное ливедо (n = 2), очаговая алопеция (n = 1), и зарегистрированный ювенильный идиопатический артрит (ЮИА) в анамнезе (n = 1) (дополнительная таблица 1a).

    Клинические признаки

    Артралгии и синовиты

    Шестнадцать из 28 пострадавших пациентов (57%) имели те или иные жалобы на суставы.У семи были артралгии без окончательной классификации суставных жалоб (15.I.1, 16.I.1, 17.I.1, 20.I.1, 21.I.1, 26.I.1, 27.I.1). 1). У одного 24-летнего мужчины (1.I.1) в анамнезе были утренняя скованность, ограниченное сгибание вперед, ночная боль и снижение ротации шейного отдела позвоночника. Визуализация показала сакроилеит, подтверждающий анкилозирующий спондилоартрит (рис. 1А). Одна 53-летняя женщина (2.I.1) с 20-летним анамнезом псориаза и узловатой эритемы сообщила о сильной боли в суставах в плечах, кистях, запястьях и лодыжках, связанной с суставными выпотами и затруднениями при передвижении; у нее был симметричный полиартикулярный синовит, ей потребовался артроцентез, инъекции стероидов и лечение сульфасалазином.Двусторонние рентгенограммы рук выявили эрозивные изменения лучезапястного и дистального межфаланговых суставов без вовлечения пястно-фаланговых или проксимальных межфаланговых суставов (рис. 1B). Этот пациент был клинически реклассифицирован с диагнозом псориатический артрит. 36-летняя женщина (3.I.1) с ювенильным идиопатическим артритом (ЮИА) в анамнезе была диагностирована в возрасте 9 лет и успешно лечилась метотрексатом до достижения ремиссии в возрасте 17 лет 15 . Ее подтип ЮИА не был ясен из записей, и неясно, будет ли ее первоначальный диагноз соответствовать обновленным рекомендациям по классификации ЮИА 15 . 46-летний мужчина (4.I.1) с историей увеита и гранулематозного дерматита сообщил о боли в суставах, начавшейся в возрасте 29 лет, поразившей сначала его левую лодыжку, а затем запястья, колени, локти и плечи. Клинический диагноз: серонегативный эрозивный ревматоидный артрит. Его история лечения включала метотрексат, этанерцепт, тоцилизумаб, абатацепт и цертолизумаб. Он прекратил все иммунодепрессанты из-за рецидивирующей пневмонии и целлюлита. Артроцентез дал 16 000 лейкоцитов, 83% нейтрофилов, 12% лимфоцитов, без идентифицированных организмов (включая отсутствие микобактерий или грибков) и без кристаллов.Рентгенограммы его коленей показали образование шпор и периартикулярную остеопению (рис. 1D).

    Рисунок 1

    Выберите аномалии, наблюдаемые в нашей когорте с дефицитом GATA2 в естественной истории болезни. ( A ) КТ, показывающая крестцово-подвздошную аномалию и периартикулярный склероз, совместимый с сакроилеитом, у 30-летнего мужчины. ( B ) Небольшие околосуставные эрозии с вовлечением дистальных межфаланговых суставов на двусторонней основе, слабо-умеренные дегенеративные изменения лучезапястных суставов на двусторонней основе и крошечные околосуставные эрозии с вовлечением проксимальных межфаланговых суставов слева у 53-летней женщины .( C ) Рентгеновское изображение, показывающее атравматическое сращение трех грудных позвонков у 20-летней женщины. ( D ) Рентгенограмма надколенниково-бедренного сустава, показывающая шпоры и размытую периартикулярную остеопению у 46-летнего мужчины; аспирация коленного сустава дала 60 000 лейкоцитов и отсутствие микроорганизмов или кристаллов острой подагры. ( E,F ) Пьезогенные папулы стопы наблюдаются при нагрузке, но не при подъеме у 22-летней женщины.

    Пьезогенные папулы стопы и гипермобильность суставов

    Шесть пациентов имели ППП (1.I.1, 5.I.1, 6.I.1, 6.I.2, 7.I.1, 7.II.1). У одной 22-летней женщины (5.I.1) с врожденным отсутствием одной почки в анамнезе и гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом, вызванным цитомегаловирусом, наблюдалась боль в руке. У нее не было синовита, болезненности, припухлости или воспалительных явлений, но были множественные PPP, 10-градусная гиперэкстензия коленей с обеих сторон и высокое арочное небо (рис. 1E, F). У 21-летней женщины (6.I.1) было атравматическое сращение трех грудных позвонков (рис. 1C), без боли в спине, бедре или паху, а также без утренней скованности или явных признаков воспаления.У нее тоже был ППП. У ее брата, 22 лет (6.I.2) с дефицитом GATA2 и остеопенией, рефрактерной к добавкам кальция и витамина D, также был ППП и двустороннее увеличение объема движений в плечах. У их матери, у которой нет дефицита GATA2, не было PPP. ППП также наблюдались у описанного выше больного анкилозирующим спондилитом (1.I.1). У другой 36-летней женщины с псориазом в анамнезе также был PPP (7.I.1), наряду с 10-градусной гиперэкстензией в локтях с обеих сторон и 15-градусной гиперэкстензией в коленях с обеих сторон.У ее 16-летней дочери (7.II.1), у которой также имеется дефицит GATA2, были обнаружены PPP, гипермобильность суставов, плоскостопие, хондромаляция надколенника и гипертелоризм, но не расщепление язычка.

    Остеопения и остеопороз с ранним началом

    Одна 22-летняя женщина (8.I.1) с выявленным при биопсии панникулитом левой ноги с эозинофилами и нейтрофилами без гистологически идентифицируемых микроорганизмов имела в анамнезе отек правого коленного сустава с выпотом, который потребовал артроцентез. КТ до трансплантации показала тяжелую потерю кортикальной кости и остеопению в двусторонних бедрах и голенях при ежедневном приеме 20  мг преднизолона.

    Для дальнейшей оценки остеопении мы рассмотрели доступные сканы DEXA для всех пациентов с дефицитом GATA2. Возраст участников составлял от 15 до 34 лет, и все доступные DEXA-сканы были выполнены у пациентов после трансплантации. Мы наблюдали, что у 8 из 54 пациентов (14,8%) показатели поясничного отдела позвоночника находились в диапазоне остеопороза (<2,5, Z-показатель). Кроме того, оценка костной трабекулярно-сетчатой ​​микроархитектоники проводилась с помощью шкал трабекулярной кости (TBS). TBS представляет собой измерение, полученное с помощью DEXA, которое определяет риск перелома независимо от минеральной плотности кости 16 . Из 30 пациентов с доступной TBS у 4 пациентов были уровни, указывающие на промежуточный риск перелома (<1,31 (13,3%)), у 2 из которых также были сканы DEXA нижнего поясничного отдела. У четырех пациентов с остеопенией/остеопорозом были другие ревматологические проявления, описанные в дополнительной таблице 1 (8.I.1, 14.I.1, 17.I.1, 23.I.1).

    Псориаз

    Было выявлено четыре пациента с псориазом в анамнезе (2.I.1, 7.I.1, 9.I.1, 10.I.1). Два из них описаны выше, один как псориатический артрит (2.I.1) и один с PPP (7.I.1). У другого пациента псориаз был успешно вылечен устекинумабом без возвращения симптомов после трансплантации (9.I.1). У 54-летнего мужчины (10.I.1) с историей болей в спине, начавшихся в возрасте 20 лет, связанных с ночными пробуждениями и утренней скованностью, при визуализации не было сакроилеита, но был псориаз в анамнезе. Лечение псориаза включало топические стероиды, осложненное тем, что в анамнезе применялся имихимод для лечения бородавок.

    Необъяснимое полисистемное заболевание с признаками аутоиммунитета (волчаночный антикоагулянт, рецидивирующий перикардит/серозит, болезнь Бехчета, симптомы сухости и гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз).

    Как четко определенные, так и не полностью определенные аутоиммунные ревматологические проявления наблюдались у шести пациентов: (1) 52-летняя женщина (11.I.1) с положительным результатом волчаночного антикоагулянта в двух случаях с интервалом >12 недель имела в анамнезе два выкидыша (диагностические критерии Саппоро для антифосфолипидного синдрома невыполнены, поскольку триместры выкидыша неизвестны), (2) 45-летняя женщина (12.I.1) с 15-летним анамнезом рецидивирующего перикардита/серозита, включая перикардит выпот с преобладанием лимфоцитов и макрофагов, гиперферритинемия и артралгии имели легочный альвеолярный протеиноз (ЛАП), несмотря как на отрицательный результат инфекционного обследования, так и на отрицательную аутовоспалительную генетическую оценку, (3) 25-летняя женщина (13.I.1), у которой в возрасте 11 лет были диагностированы болезненные орально-генитальные язвы и полиартикулярные боли в суставах, соответствующие клиническому диагнозу болезни Бехчета, (4) 27-летняя женщина (14. I.1) с ретикулярным ливедо и хроническим симптомы сухости, уменьшение слюноотделения, положительный результат ANA, положительный результат антипротеиназы 3, но отрицательный результат биопсии слюнной железы и отсутствие заметных признаков васкулита, (5) 4.I.1 с увеитом в анамнезе и (5) 21-летний мужчина мужчина (8.I.1) с гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом в анамнезе.

    Резюме инфекций, миелодиспластических и ревматологических клинических признаков

    На рис.2 мы обобщаем клинические особенности, связанные с нарушением регуляции иммунитета, которые мы наблюдали в нашей когорте. К ним относятся проявления, описанные ранее 1,2,5 . Ревматологические проявления, описанные здесь впервые, отмечены звездочкой (*). Мы также предоставляем список дифференциальных диагнозов, подходящих для любого пациента с признаками или симптомами MSK на фоне дефицита GATA2.

    Рисунок 2

    Дисрегуляция иммунной системы и MSK у пациентов с дефицитом GATA2. Резюме ранее опубликованных проявлений инфекционных, миелодиспластических и ревматологических заболеваний, наблюдаемых у пациентов с дефицитом GATA2, а также впервые описанных здесь ревматологических проявлений (обозначены звездочкой*). МДС – семейная миелодисплазия, ОМЛ – острый миелогенный лейкоз, АВН – аваскулярный некроз, МСК – скелетно-мышечный, ГЛГ/МАС – гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз/синдром активации макрофагов, ВПГ – вирус простого герпеса, ЛАП – легочный альвеолярный протеиноз, НТМ – нетуберкулезные микобактерии, РА – ревматоидный артрит, ЮИА – ювенильный идиопатический артрит.

    Иммунологические особенности

    Фенотипирование лимфоцитов

    Учитывая наблюдаемые признаки ревматологического заболевания в нашей когорте, мы стремились определить, наблюдались ли различия в пропорциях субпопуляции лимфоцитов между пациентами с дефицитом GATA2, у которых были ревматологические проявления, и у тех, у кого их не было. Мы обнаружили, что доли подмножества CD3+ CD4+ Т-хелперов были значительно ниже у пациентов с ревматологическими проявлениями, а доли CD3+ CD8+ цитотоксических Т-клеток были значительно выше (рис. 3А,Б). Кроме того, значительное снижение числа наивных хелперных Т-клеток (CD3+ CD4+ CD62L+ CD45RA+) было значительно ниже у пациентов с ревматологическими проявлениями, при этом не наблюдалось различий в эффекторных хелперных Т-клетках памяти (CD3+ CD4+ CD62L- CD45RA-) (рис. 3C, D). . Никаких существенных различий не наблюдалось с популяциями CD19+, CD3+, NK-клеток, NK-Т-клеток или наивных цитотоксических Т-клеток (рис. 3E-I). Нет существенных различий в эффекторных цитотоксических Т-клетках памяти (CD3+ CD8+ CD45RA-CD62L-), центральных хелперных Т-клетках памяти (CD3+ CD4+ CD45RA- CD62L+), центральных цитотоксических Т-клетках памяти (CD3+ CD8+ CD45RA- CD62L+) или двойных наблюдались отрицательные Т-клетки (CD3+ CD4-CD8-) (данные не показаны).

    Рисунок 3

    Фенотипирование лимфоцитов периферической крови пациентов с дефицитом GATA2. ( A ) Пропорции CD4+ CD3+ хелперных Т-клеток. ( B ) Соотношение CD8+/CD3+ цитотоксических Т-клеток. ( C ) CD3+ CD4+ CD62L+ CD45RA+ True Negative Пропорции субпопуляции наивных хелперных T-клеток. ( D ) CD3+ CD4+ CD62L- CD45RA- Пропорции субпопуляции эффекторных Т-клеток памяти. ( E ) Пропорции CD19+ В-клеток. ( F ) Пропорции CD3+ Т-клеток.( G ) Пропорции CD16+ и/или CD56+ NK-клеток. ( H ) Пропорции CD16+ и/или CD56+, CD3+ NK Т-клеток. ( I ) CD3+ CD8+ CD62L+ CD45RA+ Пропорции субпопуляции наивных цитотоксических Т-клеток. График с квадратными усами указывает на распределение 10–90%, а выбросы обозначены точками рассеяния. *p < 0,05 U-критерий Манна-Уитни. Ревматологическая группа (n = 25 из 28 пациентов) и неревматологическая группа (n = 95 из 129 пациентов).

    Обзор литературы

    Мы стремились обобщить литературу, описывающую ревматологические проявления у пациентов с дефицитом GATA2.На рисунке 4 показана блок-схема методологии обзора литературы. Было выявлено 282 уникальных записи (критерии поиска изложены в дополнительных методах). Пять дополнительных записей были включены на основе ссылок, обнаруженных во время полнотекстового обзора. Восемнадцать исследований были сочтены относящимися к ревматологическим проявлениям или механизмам GATA2, связанным с наблюдаемыми результатами, включая 11 исследований на людях (дополнительная таблица 2) и три исследования на мышах.

    Рисунок 4

    Блок-схема обзора литературы.Записи включались, если они описывали патологию GATA2 у пациентов или прямые механизмы на животных моделях и были связаны с воспалением, заболеваниями костей, мышц, переломами, спондилоартропатиями, ревматоидным артритом и другими ревматологическими проявлениями. Только выявленные исследования на людях приведены в дополнительной таблице 2.

    Рандомизированное контролируемое клиническое исследование фазы II

    Аннотация

    Цели

    Активная иммунизация или вакцинация фактором некроза опухоли (ФНО)-киноид (ФНО-К) представляет собой новый подход к индукции поликлональных антител против ФНО при иммуноопосредованных воспалительных заболеваниях. Это исследование было проведено для переноса доказательства концепции, полученной на мышиной модели ревматоидного артрита (РА), на человека. Мы разработали пилотное исследование, чтобы продемонстрировать возможность терапевтической вакцинации при РА.

    Методы

    Это было плацебо-контролируемое многоцентровое исследование фазы IIa у взрослых с РА, у которых ранее наблюдалась вторичная неэффективность антагонистов ФНО. Пациентов иммунизировали внутримышечно 2 или 3 дозами плацебо (n = 10) или 90 (n = 6), 180 (n = 12) или 360 мкг TNF-K (n = 12).Основная цель состояла в том, чтобы определить наилучшую дозу и график на основе титров антител против TNF. Клинические симптомы и безопасность оценивали в течение 12 месяцев и запрашивали реакции в течение 7 дней после каждой инъекции.

    Результаты

    Самый высокий ответ антител против TNF был обнаружен у пациентов, иммунизированных 360 мкг TNF-K и с 3 инъекциями, хотя эта разница не была значимой во всех других группах. Сходные пропорции пациентов, получавших ФНО-К и плацебо, сообщали о нежелательных явлениях до 12-го месяца.Серьезные нежелательные явления были зарегистрированы у 4 пациентов, получавших ФНО-К (13,3%), и у 3 пациентов, получавших плацебо (30,0%), причем все они не были связаны с лечением. На 12-м месяце DAS28-CRP, число болезненных и опухших суставов и показатели HAQ снизились значительно больше у пациентов, у которых наблюдался ответ антител против TNF, чем у пациентов, у которых этого не было.

    Выводы

    Терапевтическая вакцинация

    TNF-K индуцировала дозозависимые антитела против TNF у пациентов с РА и хорошо переносилась. У пациентов, у которых выработались антитела против TNF, наблюдалась тенденция к клиническому улучшению.Хотя наиболее агрессивная доза и схема, т. е. доза 360 мг, введенная 3 раза, показали сильную тенденцию к более высокому ответу антител, необходимы дальнейшие исследования для изучения еще более высоких и более частых доз, чтобы установить наилучшие условия для клинического улучшения.

    Образец цитирования: Durez P, Vandepapeliere P, Miranda P, Toncheva A, Berman A, Kehler T, et al. (2014) Терапевтическая вакцинация TNF-киноидом при резистентном к антагонистам TNF ревматоидном артрите: рандомизированное контролируемое клиническое исследование фазы II.ПЛОС ОДИН 9(12): е113465. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113465

    Редактор: Hiroyoshi Nishikawa, Передовой исследовательский центр иммунологии, Осакский университет, Япония

    Поступила в редакцию: 4 июня 2014 г .; Принято: 16 октября 2014 г .; Опубликовано: 17 декабря 2014 г.

    Авторские права: © 2014 Durez et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

    Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные содержатся в документе и файлах со вспомогательной информацией.

    Финансирование: Спонсор Neovacs, как спонсор клинического исследования, участвовал в разработке исследования, анализе данных, принятии решения о публикации и подготовке рукописи. Сотрудники Neovacs, участвовавшие в разработке исследования, анализе данных, принятии решения о публикации и подготовке рукописи: PV OD BF SO GGV.

    Конкурирующие интересы: PV OD BF SO GGV являются сотрудниками Neovacs SA и владеют акциями или опционами на акции Neovacs SA. Сбор данных и управление ими было поручено CRO Inferential (35, rue Godot de Mauroy, 75009 Париж, Франция). Вывод сыграл роль в анализе данных рукописи. Inferential не играл никакой роли в дизайне исследования, решении о публикации или подготовке рукописи. Вся эта работа соответствовала требованиям GCP. Это не меняет приверженности авторов всем политикам PLOS ONE в отношении обмена данными.

    Введение

    Ревматоидный артрит (РА) представляет собой хроническое системное иммуноопосредованное воспалительное заболевание, поражающее от 0,5 до 1% населения и приводящее к серьезной функциональной инвалидности и повышенной смертности [1]. Гиперпродукция фактора некроза опухоли (ФНО), продуцируемого активированными моноцитами и макрофагами, играет центральную роль при РА, приводя к синовиту и деградации суставного матрикса [2]. Появление препаратов, нацеленных на ФНО (анти-ФНО), резко изменило перспективы лечения РА за последнее десятилетие, дав беспрецедентные результаты с точки зрения контроля заболевания и предотвращения разрушения суставов [3].Тем не менее, только 30-40% пациентов, получавших анти-ФНО, достигли ремиссии в контролируемых клинических исследованиях [4], а в повседневной практике описаны еще более низкие показатели ремиссии [5]. Примерно такая же часть достигает функционального состояния, сравнимого с общей популяцией [6]. Первичная или вторичная терапевтическая неудача при лечении препаратами против TNF встречается часто [7], и в настоящее время имеются данные о том, что индукция антител против лекарств может быть основным фактором потери ответа на этот класс терапевтических средств, в основном при использовании анти-TNF-препаратов. моноклональные антитела к -ФНО [8], [9].Эти недостатки современных методов лечения против TNF подтверждают, что есть возможности для альтернативных способов нацеливания на этот ключевой провоспалительный цитокин.

    Среди них многообещающей разработкой является активная иммунизация против TNF с помощью TNF-Kinoid (TNF-K) [10], [11]. TNF-K состоит из человеческого TNF (hTNF), связанного с белком-носителем, гемоцианином лимфы улитки (KLH) [12]. Это соединение способно нарушать толерантность В-клеток к hTNF, тем самым индуцируя выработку поликлональных нейтрализующих антител против hTNF и обходя проблему индукции антилекарственных антител [13]. Доказательство концепции применимости TNF-K при РА было проведено на модели hTNF-трансгенных мышей (TTg) [14]. Мы продемонстрировали эффективность TNF-K при TTg как при клиническом артрите, так и при гистологическом воспалении и разрушении суставов [13], [15], [16]. Реакция антител против TNF, индуцированная TNF-K, имеет некоторые характеристики, которые являются фундаментальными для дальнейших разработок: TNF-K не сенсибилизирует Т-клетки к нативному hTNF [13], титры антител против hTNF формируются в виде колоколообразной кривой вдоль время [15], [16], эндогенный TNF не усиливает иммунный ответ [16]: нарушается только толерантность В-клеток к TNF, и только TNF-K может усиливать иммунный ответ.

    На основании проверки концепции экспериментального артрита TNF-K начал клиническую разработку. Клинические испытания фазы I, проведенные у пациентов с болезнью Крона, показали, что он хорошо переносится и иммуногенен [17]. Здесь мы сообщаем о результатах пилотного исследования фазы IIa, проведенного у пациентов с РА, у которых ранее наблюдалась вторичная неэффективность биопрепаратов против TNF. Мы наблюдали выработку антител против TNF и улучшение некоторых клинических параметров, что свидетельствует об актуальности для людей концепции терапевтической вакцинации против TNF.

    Методы

    Общая схема исследования

    Это исследование представляло собой рандомизированное двойное слепое многоцентровое клиническое исследование фазы II, в котором изучались безопасность и иммунный ответ TNF-K у взрослых с РА, у которых ранее наблюдалась вторичная неэффективность биологических препаратов против TNF (регистрационный номер ClinicalTrials.gov № NCT01040715). ). Основная цель состояла в том, чтобы определить наилучшую дозу и график введения TNF-K с точки зрения ответа антител против TNF, индуцированного либо двумя инъекциями (0 и 28 день), либо тремя инъекциями (0, 7 и 28 день) TNF. -K в 3 дозировках (90, 180 или 360 мкг).Исследование проводилось в 21 центре в Аргентине, Бельгии, Болгарии, Чили, Хорватии, Франции и Румынии в соответствии с Руководством Европейского агентства по лекарственным средствам по клинической оценке новых вакцин, Руководством Международного комитета по гармонизации по надлежащей клинической практике и Декларацией Хельсинки (пересмотр 52 и Генеральной ассамблеи Всемирной медицинской ассоциации, Эдинбург, Шотландия, октябрь 2000 г. ). Протокол исследования был одобрен комитетами по медицинской этике во всех участвующих учреждениях, как указано ниже:

    Независимый комитет по этике для Ensayos en Pharmacologia Clinica (Fefym), Буэнос-Айрес; Institucional de Etica en Investigacion en Salud (CIEIS), Sociedad de Beneficencia Hospital Italiano, город Кордова; Комитет по этике Центра ревматологических расследований, Сан-Мигель-де-Тукуман; Comité de Docencia e Investigacion – Centro Medico Privado de Reumatologia, Сан-Мигель-де-Тукуман; Аргентина.Université Catholique de Louvain Faculté de Médecine Commission d’Ethique Biomédicale Hospitalo-Facultaire, 1200 Bruxelles, Бельгия. Комитет по этике многоцентровых клинических исследований, София, Болгария. Comité Etico Cientifico Del servicio de Salud Metropolitano Oriente (SSMO) Провиденсия, Сантьяго, Чили. Центральный комитет по этике, агентство по лекарственным средствам и медицинским изделиям, Загреб, Хорватия. Комитет по защите людей (CPP), Иль-де-Франс II, Париж, Франция. Министерство здравоохранения, Национальный комитет по этике клинических исследований лекарственных средств, Бухарест, Румыния.CEIC de Asturias, Центральный университетский госпиталь Астурии, Овьедо, Испания. Комиссия по этике научных исследований в отношении человека, Лозанна, Швейцария.

    Пациенты дали письменное информированное согласие до включения в исследование.

    Протокол этого испытания и вспомогательный контрольный список CONSORT доступны в качестве вспомогательной информации; см. контрольный список S1 и протокол S1.

    пациентов

    Взрослые в возрасте от 18 до 70 лет с РА рассматривались для включения, если у них был РА, диагностированный не менее чем за 6 месяцев до этого в соответствии с пересмотренными критериями 1987 года Американского колледжа ревматологов (ACR) и DAS28-CRP>3.2 при скрининге [18]. В период с 1 марта 2010 г. по 11 августа 2011 г. пациентов включали в исследование, если у них был первоначальный ответ (ответ ACR20, снижение DAS28-C-реактивного белка [CRP] ≥1,2 или по мнению исследователя) на антагонист TNF. (инфликсимаб, адалимумаб, этанерцепт, цертолизумаб или голимумаб) с последующей неудачей лечения (увеличение DAS28≥0,6 за последние 6 мес, снижение балла EULAR или по мнению исследователя). Метотрексат разрешался, если его вводили в стабильной дозе ≤20 мг/нед в течение не менее 4 нед.Прием других небиологических противоревматических препаратов необходимо было прекратить в течение 4 недель до первого введения исследуемого продукта. Пациенты не могли ранее получать какую-либо биологическую терапию РА, кроме антагонистов ФНО. Они также были исключены, если они получали внутрисуставные кортикостероиды в течение 3 месяцев, имели документированную тяжелую бактериальную инфекцию в течение 28 дней, имели в анамнезе или в настоящее время застойную сердечную недостаточность, имели в анамнезе активный или латентный туберкулез, были положительными для человека. вирус иммунодефицита, вирус гепатита С или вирус гепатита В, или получили любую живую вакцину в течение 3 месяцев.Дата завершения исследования – 16 июля 2012 г. (12-й месяц).

    Процедуры

    TNF-K получали сшивкой альдегидом рекомбинантного человеческого TNF и KLH, как описано ранее [13], [15]. Вкратце, KLH и рекомбинантный TNF человека смешивали в молярном соотношении 1:37 и сшивали 25 мМ глутаральдегидом, гасили глицином, инактивировали 250 мМ формальдегидом и снова гасили глицином. Продукт очищали ультрафильтрацией в фосфатном буфере, стерилизовали пропусканием через фильтр 0.22-мкм фильтр, приготовленный с маннитом перед лиофилизацией и хранящийся при 4°C. Перед введением TNF-K восстанавливали водой для инъекций (180 мкг в 0,3 мл воды) и эмульгировали с равным объемом адъюванта ISA-51VG (Seppic, Puteaux, France) для получения одной дозы. Пациенты, получавшие 90 мкг ФНО-К, получали половину полностью восстановленной дозы; пациентам, получавшим 360 мкг TNF-K, вводили 2 полностью восстановленные дозы. Плацебо представляло собой эквивалентное количество стабилизатора (маннита) в 0,0001 г.3 мл воды и эмульгировали с равным объемом адъюванта ИСА-51ВГ. И TNF-K, и плацебо поставлялись в виде белого пирога в флаконах с одинаковыми номерами, чтобы пациент и исследователь не знали о назначенном лечении. Дозы вводили внутримышечно в дельтовидную область руки.

    Лечение было назначено случайным образом с использованием схемы последовательного постепенного введения доз (рис. 1). На каждом этапе пациенты также были рандомизированы в группу исследования и 1∶1 для получения 2 доз (день 0, 28) или 3 доз (день 0, 7, 28).Рандомизация осуществлялась через центральную интерактивную систему веб-ответов с использованием списка рандомизации, созданного с помощью SAS (Институт SAS, Кэри, Северная Каролина). Для этапов 1 и 2, после того как 3 пациента были зарегистрированы в течение как минимум 7 дней, и если независимый DSMB (iDSMB) не выявил проблем с безопасностью и не было сообщено о связанных с ними серьезных нежелательных явлениях, регистрация на последующем этапе начиналась параллельно.

    Рисунок 1. Дизайн исследования.

    На первом этапе 8 пациентов были рандомизированы 3∶1 для получения 90 мкг TNF-K или плацебо, на втором этапе 16 пациентов были рандомизированы 3∶1 для приема 180 мкг TNF-K или плацебо, а на третьем, 17 пациентов были рандомизированы 3∶1 для получения 360 мкг TNF-K или плацебо. На каждом этапе пациенты также были рандомизированы 1 на 1 для получения 2 доз (день 0, 28) или 3 доз (день 0, 7, 28) (стрелки). Для этапов 1 и 2, после включения 3 пациентов и отсутствия сообщений о проблемах безопасности в течение по крайней мере 7 дней, параллельно начинался набор на последующий этап. Один пациент, рандомизированный для получения 3 доз 360 мкг ФНО-К, отозвал свое согласие до начала лечения. Основная аналитическая часть исследования продолжалась до 84-го дня, а последующая часть продолжалась до 12-го месяца.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113465.g001

    Измерение титров антител против TNF и нейтрализующей способности

    Титры антител против TNF измеряли в сыворотках, собранных в дни 0, 17, 28, 38, 56, 84, 112, 140, 168, 252 и 336, с использованием прямого твердофазного иммуноферментного анализа, в котором планшеты для микротитрования покрывали рекомбинантный TNF человека [13]. Анализировали серийные 2-кратные разведения образцов сыворотки. Титр определяли как самое высокое разведение образца, для которого оптическая плотность была более чем в 3 раза больше оптической плотности пула сывороток здоровых добровольцев, которые добавляли во все планшеты в качестве отрицательного контроля.Оптическую плотность считывали при 490 нм. Нижним пределом количественного определения был титр 200 (1/разведение). TNF-нейтрализующие антитела измеряли, как описано ранее [19].

    Анализ лимфопролиферации

    Мононуклеарные клетки периферической крови пациентов выделяли центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-hypaque, добавляли (200 000 на лунку) в круглодонные 96-луночные планшеты и инкубировали при 37°C только со средой или с TNF-K, рекомбинантным TNF человека. (Boehringer Ingelheim, Ингельхайм-на-Рейне, Германия) или KLH (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) при 0.1, 1 и 10 мкг/мл. Через 72 ч включение [ 3 H]-тимидина оценивали, как описано ранее [13]. Все образцы были испытаны в четырехкратной повторности. Индекс стимуляции рассчитывали как число импульсов в минуту с поправкой на фон для стимулированных клеток, деленное на число импульсов в минуту с поправкой на фон для клеток, культивируемых только в среде. В этом многоцентровом исследовании пациенты из центров за пределами Европы не анализировались, поскольку выделение РВМС не могло быть выполнено в течение 24 часов в центральной лаборатории, расположенной в Европе.Таким образом, только 16 пациентов (10 иммунизированных TNF-K и 6 плацебо) были проанализированы на Т-клеточный ответ.

    Измерение антилекарственных антител

    Оценка антилекарственных антител проводилась с помощью мостового ИФА LISA-TRACKER Premium от Theradiag (Croissy-Beaubourg, Франция) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, серийно разбавленные сыворотки пациентов добавляли в планшет, предварительно покрытый лекарственным средством, затем добавляли биотинилированное лекарственное средство. После последовательных промывок добавляли стрептавидин-HRP и проявляли соответствующим субстратом. Затем определяли оптическую плотность при 450 нм.

    Оценка клинической эффективности

    DAS28-CRP, число опухших и болезненных суставов, ответ EULAR [20], [21], концентрацию CRP в крови, индекс HAQ и частоту ответов ACR20, ACR50 и ACR70 [18], [22] оценивали в дни 0, 84, 168 и 336.

    Нежелательные явления

    Были зарегистрированы нежелательные явления (НЯ) и их возникновение, интенсивность и связь с иммунизацией TNF-K. НЯ, серьезные нежелательные явления (СНЯ), все отклонения при физикальном обследовании, основных показателях жизнедеятельности, электрокардиограмме в 12 отведениях и клинико-лабораторных оценках регистрировались вплоть до 12-го месяца.Желаемые местные реакции (боль, болезненность, эритема, отек, зуд, уплотнение и изъязвление) и желаемые системные реакции (лихорадка, рвота, головная боль, утомляемость, миалгия и тошнота) регистрировались пациентами в дневниковых карточках в течение 7 дней после каждой дозы. TNF-K или плацебо.

    Статистический анализ

    Все анализы были выполнены для всех пациентов, получивших хотя бы одну дозу ФНО-К или плацебо. Средние геометрические титры (GMT) анти-TNF и анти-KLH антител рассчитывали по log 10 трансформированных титров.Для расчета GMT титры ниже нижнего предела обнаружения (200) были преобразованы в половину нижнего предела обнаружения (100). По оценкам, 48 пациентов (по 12 в группе) достигли 80% мощности, чтобы обнаружить разницу в 75% между пропорциями групп пациентов с по крайней мере 3-кратным увеличением ответа антител против TNF по сравнению с отсечкой на 38-й день. с использованием двустороннего точного критерия Фишера и уровня значимости 0,008, учитывающего множественное сравнение. В апостериорных анализах ответ антител определялся как титр ≥200 в любой момент времени, и клинические баллы сравнивались между ответившими и не ответившими антителами (пациенты с (n = 23) и без (n = 17) обнаруживаемых анти-TNF-антител. антител соответственно) с использованием непараметрических критериев суммы рангов Вилкоксона.Считалось, что значение p <0,05 указывает на статистически значимую разницу для этих апостериорных анализов. Все расчеты проводились с использованием SAS версии 9.2 (SAS Institute, Cary, NC) или Excel версии 14.0.6123.5000 (Microsoft, Redmond, WA).

    Результаты

    Расположение пациентов и исходные характеристики

    В период с 1 марта 2010 г. по 11 августа 2011 г. было включено

    пациента (таблица 1). В соответствии с протоколом только 6 пациентов были включены в группу 90 мкг из-за низкой частоты ответа антител.Следовательно, инъекции были сделаны сорока пациентам (рис. 1). Один пациент, рандомизированный в группу с дозой 360 мкг TNF-K, не получал лечения. Все пациенты завершили первичную фазу к 3-му месяцу, а 32 пациента завершили исследование до 12-го месяца. Из восьми пациентов, выбывших в период с 3-го по 12-й месяц, 4 были в связи с отсутствием клинического улучшения, 2 — по решению исследователя по соображениям безопасности (обострение). РА и персистирующего РА соответственно), 2 отозвали согласие.

    Исходные характеристики заболевания были сходными в четырех группах лечения. Из 40 пролеченных пациентов 15 получали инфликсимаб (12 в группах ФНО-К и 3 в группе плацебо), 12 получали адалимумаб (8 в группах ФНО-К и 4 в группе плацебо), 2 получали цертолизумаб. (1 в группах TNF-K и 1 в группе плацебо), и 17 получали этанерцепт (12 в группах TNF-K и 5 в группе плацебо). Шесть пациентов (3 в группе TNF-K и 3 в группе плацебо) ранее получали лечение как минимум двумя моноклональными антителами. Четырнадцать (35.0%) из 40 пациентов были положительными на антилекарственные антитела при скрининге: у 8 были антитела к инфликсимабу, у 3 были антитела к адалимумабу и у 3 были антитела как к инфликсимабу, так и к адалимумабу.

    Иммуногенность

    Иммунизация TNF-K индуцировала дозозависимое и зависящее от схемы увеличение уровней антител против TNF (рис. 2A), хотя существенной разницы между группами TNF-K не было обнаружено для первичной конечной точки (таблица S1). GMT были численно выше у пациентов, получавших 360 мкг TNF-K, чем у пациентов, получавших 90 или 180 мкг. У всех 12 пациентов, иммунизированных 360 мкг TNF-K, наблюдался гуморальный ответ (т. е. определяемые антитела против TNF по крайней мере в 1 момент времени), тогда как не более двух третей пациентов, получавших 90 или 180 мкг TNF-K, были антителами. респонденты (рис. 2B). У пациентов, получавших 360 мкг TNF-K, GMT были самыми высокими на 112-й день (3 дозы) или 140-й день (2 дозы), после чего титры постепенно снижались. При этой дозе TNF-K GMT были выше у пациентов, которым вводили 3 дозы (в дни 0, 7 и 28), чем у пациентов, которым вводили 2 дозы (в дни 0 и 28).

    Рисунок 2. Гуморальный иммунный ответ на TNF.

    Пациенты получали 2 дозы (дни 0 и 28) или 3 дозы (дни 0, 7 и 28) плацебо или 90, 180 или 360 мкг TNF-K. Титры антител против TNF определяли с помощью иммуноферментного анализа. (А) по Гринвичу. (B) Процент пациентов в каждой группе лечения с определяемыми антителами к TNF (титр ≥200) до 3-го месяца (на 38-й, 56-й или 84-й день исследования), на 6-й месяц, на 12-й месяц или в любое время до до 12 месяцев (т. е. респондеры антител).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113465.g002

    Большинство антител относятся к изотипам IgG1 и IgG3, антитела IgE не обнаружены (рис. S1). Антитела к TNF не были обнаружены в группе плацебо (таблица S1). Нейтрализующая активность ФНО, измеренная в сыворотке, собранной на 56-й день, не обнаруживалась ни у одного пациента при разведении 1/100 на клетках L929 (таблица S2).

    Иммунный ответ

    Т-клеток оценивали путем измерения лимфопролиферации in vitro.Как показано на рис. 3, высокие индексы стимуляции были получены с TNF-K и KLH; важно, что на TNF не наблюдалось ответа Т-клеток (таблица S3).

    Рисунок 3. Ответ Т-клеток на TNF.

    Мононуклеарные клетки периферической крови собирали в дни 0 и 56 и обрабатывали in vitro средой (контроль) или 10 мкг/мл TNF-K, TNF или KLH. Лимфопролиферацию оценивали через 72 ч по включению 3 Н-тимидина. Показан индекс стимуляции (кратное увеличение лимфопролиферации по сравнению сконтроль) для клеток пациентов, получавших плацебо (n = 6) или TNF-K (n = 10).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113465.g003

    Нежелательные явления

    Частота ожидаемых реакций (в месте инъекции и системных реакций) была сопоставима у пациентов, получавших ФНО-К, и у пациентов, получавших плацебо (таблица 2). Наиболее распространенными местными реакциями были боль и болезненность в месте инъекции, а миалгия была наиболее распространенной системной реакцией, за которой следовали утомляемость и головная боль.Большинство реакций были легкой и средней степени выраженности. Тяжелые реакции у пациентов, получавших ФНО-К, встречались не чаще, чем у пациентов, получавших плацебо.

    НЯ были зарегистрированы большинством пациентов, получавших ФНО-К (23/30 [76,7%]) или плацебо (9/10 [90,0%]), а об инфекциях сообщали аналогичные доли пациентов, получавших ФНО-К и плацебо. (43,3% против 50,0%). О НЯ, связанных с лечением, сообщили 14 пациентов, получавших ФНО-К (46,7%), и 6 пациентов, получавших плацебо (60,0%).Одно несерьезное НЯ, которое, возможно, было связано с лечением (умеренный полиартрит через 57 дней после второй дозы 180 мкг ФНО-К), привело к досрочному прекращению лечения, а один пациент, получавший ФНО-К, сообщил о тяжелом НЯ (головная боль). следователь должен быть связан с лечением.

    SAE были зарегистрированы у 4 пациентов, получавших TNF-K (13,3% – инфекция мочевыводящих путей, лейомиома, многоочаговая карцинома щитовидной железы, синовит) и у 3 пациентов, получавших плацебо (30,0% – перелом плечевой кости и поломка устройства, бурсит, бронхит).Ни одно из СНЯ не считалось связанным с лечением. До 12 месяцев не было зарегистрировано ни одного случая серьезной инфекции, туберкулеза, злокачественных новообразований, анафилактических реакций, реакций, подобных сывороточной болезни, а также летальных исходов, связанных с лечением.

    Клиническая эффективность

    Показатели клинического ответа в группах TNF-K и плацебо существенно не различались, но незначительная тенденция к улучшению клинического ответа наблюдалась у пациентов, получавших 360 мкг TNF-K, у которых наблюдался наиболее выраженный ответ антител.Таким образом, в ретроспективном анализе клинические ответы сравнивали между ответившими антителами (n = 23) и неответившими (n = 17).

    DAS28-CRP, среднее количество чувствительных суставов, количество опухших суставов, общая оценка пациента, общая оценка врача, оценка пациентом боли и показатель HAQ постепенно улучшались до 12 месяцев у пациентов, ответивших на антитела, тогда как у пациентов не наблюдалось четкой тенденции с течением времени. которые оставались отрицательными в отношении антител против TNF (рис. 4). Через 12 месяцев у лиц, ответивших на антитела, наблюдалось значительно большее снижение по сравнению с исходным уровнем, чем у лиц, не ответивших на DAS28-CRP (p = 0.011 с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона), количество болезненных суставов (p = 0,008), количество опухших суставов (p = 0,007), общая оценка активности врача (p = 0,030) и оценка инвалидности/функции HAQ (p = 0,049).

    Рисунок 4. Отличие от исходного уровня для клинических оценок у респондеров и нереспондеров антител против TNF.

    Апостериорный анализ: Средние изменения клинических оценок по сравнению с исходным уровнем показаны через 3, 6 и 12 месяцев для ответивших антител (обнаруживаемые антитела к TNF в любое время; серые столбцы) и для не ответивших (белые столбцы). (А) DAS28-СРБ. (Б) СРБ. (C) Количество нежных суставов. (D) Количество опухших суставов. (E) Общая оценка активности пациента. (F) Оценка общей активности врача. (G) Оценка боли пациентом. (H) Изменение оценки инвалидности/функций по шкале HAQ. Столбики погрешностей указывают на стандартную ошибку среднего. P-значения определяли с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона. NS, недостоверно (p≥0,05). У респондеров n = 19 на 3-м месяце, 16 на 6-м и 12-м месяцах, за исключением 3-го месяца для Physician GAS n = 18 и для CRP n = 20. У не ответивших n = 17 на 3-м месяце и 15 на 6-м месяце 12, за исключением месяца 6, n = 14 для СРБ и балла DAS 28.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113465.g004

    Обсуждение

    Это пилотное исследование показало, что TNF-K способен индуцировать антитела против TNF у пациентов с РА, у которых наблюдалась вторичная неэффективность биопрепаратов против TNF. Этот гуморальный ответ был дозозависимым, так как только у пациентов, иммунизированных 360 мкг TNF-K, был полный гуморальный ответ. Таким образом, активная антицитокиновая иммунизация Киноидом оказалась осуществимой у людей против TNF, как показано здесь, а также против IFNα, как сообщалось ранее у пациентов с волчанкой [23].Предыдущие исследования с двумя другими агентами, сочетающими TNF и чужеродный носитель (CYT007-TNFQb и AutoVac TNF106), индуцировали высокие титры нейтрализующих антител у мышей, но были слабо иммуногенны у людей [24]–[26]. Мы не обнаружили нейтрализующей активности в сыворотках, собранных на 56-й день с помощью классического теста с использованием клеток L929 в разведении 1/100, несмотря на высокие титры антител к TNF и некоторый клинический эффект. Это может быть объяснено слишком ранней оценкой нейтрализующих антител или тем фактом, что связывающие антитела сами по себе могут усиливать клиренс ФНО за счет образования иммунных комплексов.Мы также показали, что клеточный ответ был сильным, когда PBMC от пациентов, иммунизированных TNF-K, стимулировали TNF-K или белком-носителем (KLH). Напротив, TNF-K не индуцировал Т-клеточный ответ на нативный TNF, что означает отсутствие индукции аутореактивных Т-клеток, специфичных к TNF. Этот результат был ожидаемым, поскольку он также наблюдался в наших предыдущих исследованиях на мышах, трансгенных по TNF [13], [15]–[16]. Отсутствие ответа Т-клеток на нативный цитокин также наблюдалось при применении IFN-K, несмотря на сильный гуморальный ответ у пациентов с волчанкой [23].Этот ответ Т-клеток, ограниченный белком-носителем или Киноидом, подтверждает, что, подобно классическим педиатрическим вакцинам, белок-носитель обеспечивает помощь Т-клеток поликлональному В-клеточному ответу на конъюгированный цитокин [27].

    Это исследование также показало, что TNF-K хорошо переносится. Инъекция TNF-K не вызывала каких-либо серьезных местных реакций, и не было выявлено никаких непредвиденных проблем с безопасностью. Случаев тяжелой инфекции, в том числе туберкулеза, не наблюдалось. Необходимо провести более масштабные исследования, чтобы оценить абсолютный риск тяжелой инфекции, включая туберкулез, и сравнить с другими стратегиями блокады ФНО [28].

    Несмотря на небольшой размер исследования и тот факт, что оно не было специально направлено на выявление клинических улучшений, мы наблюдали прогрессивные и значительные улучшения в группе респондеров с антителами по сравнению с нереспондерами; это было замечено для DAS28-CRP, числа болезненных и опухших суставов, общей оценки активности врача и оценки инвалидности/функции HAQ, что свидетельствует о клиническом эффекте поликлональных антител против TNF, индуцированных TNF-K. Аналогичное наблюдение было сделано на моделях мышей с ассоциацией статуса иммунного ответа на TNF-K с клиническим ответом [29].

    Потенциальной погрешностью в нашем исследовании является отсутствие стратификации в отношении предыдущего лечения анти-ФНО. Действительно, Van Vollenhoven et al недавно сообщили, что этанерцепт в качестве второго анти-ФНО после потери эффективности первого анти-ФНО (адалимумаб или инфликсимаб) дает лучший клинический ответ, чем адалимумаб или инфликсимаб после этанерцепта [30]. Этот эффект не связан с иммуногенностью, т.е. с выработкой специфических антилекарственных антител к одному анти-ФНО [31]. В нашем исследовании у 8 из 12 пациентов в группе, принимавшей 360 мкг, была вторичная неудача при приеме этанерцепта, дисбаланс, который мог привести к отрицательному смещению в нашем исследовании.Однако наилучший клинический ответ наблюдался у пациентов с наиболее высокими титрами антител и, по-видимому, не влиял, хотя количество пациентов не позволяет делать определенные выводы. Одной из гипотез может быть то, что ответ поликлональных антител, индуцированный терапевтической вакцинацией, обходит это ограничение моноклональных антител. Для решения этого вопроса необходимы дальнейшие испытания.

    В заключение, это пилотное исследование показало, что терапевтическая вакцинация против TNF с помощью TNF-K была осуществимой, безопасной и многообещающей при РА.Необходимы дальнейшие исследования для изучения более высоких и повторных доз, чтобы установить наилучшие условия для клинического улучшения.

    Дополнительная информация

    S1 Рис.

    Среднегеометрическая кратность сероконверсии по изотипу. Антитело против TNF было обнаружено с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, как описано ранее (Le Buanec et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103(51):19442-7), но с изотип-специфическими вторичными антителами. Коэффициент сероконверсии рассчитывали как отношение экстраполированной оптической плотности для максимального разведения тестируемой сыворотки к средней оптической плотности для пула сыворотки от 3 здоровых доноров.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113465.s001

    (PDF)

    S1 Протокол.

    Протокол исследования. Рандомизированное двойное слепое контролируемое исследование фазы II для оценки иммунных реакций, безопасности и клинической эффективности трех доз TNF-Kinoid у взрослых пациентов с ревматоидным артритом, у которых возник рецидив, несмотря на биологическую терапию против TNF.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0113465.s005

    (PDF)

    Благодарности

    Авторы благодарят Drs.Филипп Левенталь и Энн Хепберн (4Clinics, Париж, Франция) за научные статьи и доктор Сильви Ди Никола (Inferential, Париж, Франция) за статистический анализ.

    Авторские взносы

    Задумал и спроектировал эксперименты: ПД ПВ ОД БФ СО ГГВ МКБ. Выполнены опыты: ПД ПМ АТ АБ ТК ЭМ БФ ХМ СО ГГВ МКБ. Проанализированы данные: ПД ПВ СО ГГВ МКБ. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты анализа: PD PV PM AT AB TK EM BF XM OD BF SO GGV MCB. Написал работу: ПД ПВ ПМ АТ АБ ТК ЭМ БФ ХМ ОД БФ СО ГГВ МКБ.

    Каталожные номера

    1. 1. Скотт Д.Л., Вулф Ф., Хейзинга TWJ (2010)Ревматоидный артрит. Ланцет 376:1094–1108
    2. 2. McInnes IB, Schett G (2011)Патогенез ревматоидного артрита. N Engl J Med 365:2205–2219
    3. 3. Breedveld FC, Combe B (2011)Понимание новых парадигм лечения ревматоидного артрита. Arthritis Res Ther 13 Suppl 1: S3
    4. 4. Sfikakis PP (2010)Первое десятилетие биологических антагонистов TNF в клинической практике: извлеченные уроки, нерешенные проблемы и направления на будущее.Curr Dir Autoimmun 11:180–210
    5. 5. Hetland ML, Christensen IJ, Tarp U, Dreyer L, Hansen A, et al. (2010) Прямое сравнение ответа на лечение, показателей ремиссии и приверженности лечению у пациентов с ревматоидным артритом, получавших адалимумаб, этанерцепт или инфликсимаб: результаты восьмилетнего наблюдения за клинической практикой в ​​общенациональном Дании. Ревматоидный артрит 62:22–32
    6. 6. Рассел А.С. (2008)Оценка качества жизни при ревматоидном артрите.Фармакоэкономика 26:831–846.
    7. 7. Rubbert-Roth A, Finkh A (2009)Варианты лечения пациентов с ревматоидным артритом, у которых не удалась начальная терапия ингибитором TNF: критический обзор. Arthritis Res Ther 11 Suppl 1: S1
    8. 8. Van Schouwenburg PA, Rispens T, Wolbink GJ (2013)Иммуногенность биологической терапии против TNF при ревматоидном артрите. Nat Rev Rheumatol 9:164–172
    9. 9. Муллеман Д., Дюкуро Э., Пайнто Г., Тернант Д., Ватье Х. и др.(2012) Следует ли анализировать уровни препаратов против TNF-α и/или антител против препаратов у пациентов, получающих лечение от ревматоидного артрита? Совместная кость, позвоночник 79:109–112
    10. 10. Semerano L, Assier E, Delavallée L, Boissier MC (2011)Киноид фактора некроза опухоли человека-альфа при ревматоидном артрите. Expert Opin Biol Ther 11:545–550
    11. 11. Битон Дж., Семерано Л., Делавалле Л., Лемейтер Д., Лабори М. и др. (2011)Взаимодействие между TNF и регуляторными Т-клетками в мышиной модели артрита, управляемой TNF.Дж. Иммунол 186:3899–3910
    12. 12. Харрис Дж. Р., Маркл Дж. (1999) Гемоцианин лимфы замочной скважины (KLH): биомедицинский обзор. Микрон 30: 597–623.
    13. 13. Ле Буанек Х., Делавалье Л., Бессис Н., Патуранс С., Биззини Б. и др. (2006) TNF-альфа-киноидные нейтрализующие антитела к TNF-альфа, индуцированные вакцинацией, защищают мышей от аутологичного TNF-альфа-стимулируемого хронического и острого воспаления. Proc Natl Acad Sci USA 103:19442–19447
    14. 14. Hayward MD, Jones BK, Saparov A, Hain HS, Trillat A-C, et al.(2007)Обширная фенотипическая характеристика трансгенных мышей hTNFalpha. БМС Физиол 7:13
    15. 15. Делавалле Л., Ле Буанек Х., Бессис Н., Ассье Э., Денис А. и др. (2008) Ранняя и длительная защита от артрита у трансгенных мышей, трансгенных по фактору некроза опухоли альфа (ФНО-альфа), вакцинированных против ФНО-альфа. Энн Реум Дис 67:1332–1338
    16. 16. Делавалле Л., Семерано Л., Ассье Э., Фогель Г., Вуаньо Г. и др. (2009) Активная иммунизация к фактору некроза опухоли-альфа эффективна при лечении хронического установившегося воспалительного заболевания: долгосрочное исследование на трансгенной модели артрита.Артрит Res Ther 11: R195
    17. 17. Вандепапельер П., Малан Ф., Роглер Г., ван дер Бийл А., Крюгер Ф.К. и др. (2011)Безопасность, иммуногенность и клиническая фаза I-II результатов иммунотерапии TNFα-киноидов у пациентов с болезнью Крона. Гастроэнтерология 140:S–123.
    18. 18. Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF и др. (1988) Американская ассоциация ревматизма в 1987 году пересмотрела критерии классификации ревматоидного артрита. Ревматоидный артрит 31: 315–324.
    19. 19. Флик Д.А., Гиффорд Г.Е. (1984)Сравнение клеточных цитотоксических анализов in vitro на фактор некроза опухоли. J Immunol Methods 68:167–175.
    20. 20. Алетаха Д., Нелл В.П.К., Штамм Т., Уффманн М., Пфлюгбейл С. и др. (2005) Реагенты острой фазы мало что добавляют к комбинированным показателям активности заболевания при ревматоидном артрите: проверка оценки клинической активности. Arthritis Res Ther 7:R796–806
    21. 21. Van Gestel AM, Haagsma CJ, van Riel PL (1998)Подтверждение критериев улучшения ревматоидного артрита, которые включают упрощенный подсчет суставов.Ревматоидный артрит 41:1845–1850
    22. 22. Gaujoux-Viala C, Mouterde G, Bailet A, Claudepierre P, Fautrel B, et al. (2012) Оценка активности заболевания при ревматоидном артрите: какой составной индекс лучше? Систематический литературный анализ исследований, сравнивающих психометрические свойства DAS, DAS28, SDAI и CDAI. Совместная кость, позвоночник 79:149–155
    23. 23. Лауверис Б.Р., Хачулла Э., Спертини Ф., Лазаро Э., Йоргенсен С. и др. (2013)Снижение активности интерферона у пациентов с системной красной волчанкой путем активной иммунизации альфа-киноидом интерферона. Ревматоидный артрит 65:447–456
    24. 24. Спон Г., Гулер Р., Йохансен П., Келлер И., Джейкобс М. и др. (2007)Вакцина на основе вирусоподобных частиц, избирательно воздействующая на растворимый ФНО-альфа, защищает от артрита, не вызывая реактивации латентного туберкулеза. Дж. Иммунол 178:7450–7457.
    25. 25. Зуани-Аморим С., Манлиус С., Далум И., Дженсен М.Р., Гаутам А. и др. (2004) Индукция продукции аутоантител к ФНО-альфа с помощью AutoVac TNF106: новый терапевтический подход к лечению аллергических заболеваний.Int Arch Allergy Immunol 133:154–163
    26. 26. Уотерстон А.М., Салуэй Ф., Андреакос Э., Батлер Д.М., Фельдманн М. и др. (2004) Автовакцинация TNF индуцирует собственные антитела против TNF и ингибирует метастазирование в модели мышиной меланомы. Бр Дж Рак 90:1279–1284
    27. 27. Шнеерсон Р., Баррера О., Саттон А., Роббинс Дж. Б. (1980) Получение, характеристика и иммуногенность конъюгатов полисахарид-белок Haemophilus influenzae типа b. J Exp Med 152: 361–376.
    28. 28.Сайденберг-Керманах Н., Семерано Л., Наккаш Дж. М., Браунер М., Фальгароне Г. и соавт. (2012)Скрининг на латентный туберкулез у пациентов-кандидатов против TNF-α в условиях высокой заболеваемости туберкулезом. Int J Tuberc Lung Dis 16:1307–1314
    29. 29. Семерано Л., Битон Дж., Делавалле Л., Дювалле Э., Ассье Э. и др. (2013)Защита от повреждения суставов с помощью пассивной или активной иммунотерапии против фактора некроза опухоли (ФНО)-α у мышей, трансгенных по ФНО-α, зависит от уровней антител против ФНО-α.Clin Exp Immunol 172:54–62
    30. 30. Chatzidionysiou K, Askling J, Eriksson J, Kristensen LE, van Vollenhoven R, et al. . (2013) Эффективность смены ингибитора ФНО при РА: результаты национального шведского регистра. Энн Реум Дис. 2014 г., 15 января. doi:[]10.1136/annrheumdis-2013-204714. [Epub перед печатью].
    31. 31. Spinelli FR, Valesini G (2013)Иммуногенность препаратов против фактора некроза опухоли при ревматических заболеваниях. Clin Exp Rheumatol 31: 954–63.

    Динамика одноклеточного хроматина и транскриптома синовиальных фибробластов при переходе от гомеостаза к патологии при моделировании артрита, вызванного TNF человеческие пациенты. Клетки, вызывающие патогенность в пораженных суставах, включают увеличивающуюся массу синовиальных фибробластов (СФ), обычно инфильтрированных миелоидными и лимфоидными клетками, которые вместе способствуют развитию инвазивного паннуса, разрушающего хрящ и способствующего остеолизу

    1,2 .Ранние исследования на трансгенных мышах установили ключевую роль TNF в управлении полным патогенным процессом 3,4 . Позднее это было подтверждено у людей введением терапии против TNF, которая доказала свою эффективность в нейтрализации заболевания у большого процента пациентов с ревматоидным артритом (RA) 5 . Дальнейшие генетические исследования на мышиных моделях артрита показали, что, в частности, передача сигналов TNF в синовиальных фибробластах (SFs) опосредует постоянную активацию фибробластов и способствует пролиферативным, иммунорегуляторным и инвазивным характеристикам. Эти функции необходимы и достаточны для организации инициации и прогрессирования воспалительной и повреждающей патологии даже при отсутствии адаптивных иммунных ответов 6–8 , квалифицирующих SF как ключевые эффекторные клетки и важнейшую терапевтическую мишень при хроническом артрите.

    SF являются основным клеточным компонентом синовиальной оболочки, высокоспециализированной, многофункциональной соединительнотканной мембраны, состоящей из двух анатомически различных слоев: выстилающих SF (LSF) и недавно идентифицированных макрофагов выстилки CXCR3+ 9 , которые образуют тонкий внешний слой, прилегающий к к самым внутренним структурам, состоящим из сублинейных SF (SLSF), макрофагов, жировых клеток, нервов и кровеносных сосудов 10 .СФ в провоспалительном микроокружении РА приобретают агрессивный фенотип, напоминающий трансформированные мигрирующие опухолеподобные клетки 11 . Они действуют как иммуномодулирующие клетки, секретируя цитокины и хемокины, и опосредуют разрушение хряща за счет сверхэкспрессии матриксных металлопротеаз MMP1, MMP3 и MMP9 12,13 , а также активатора рецептора лиганда NF-κB (RANKL/ Tnfsf11 ), который вызывает чрезмерный остеокластогенез, приводящий к эрозии кости 14,15 .

    Гистопатологический анализ суставов при РА и исследования с использованием комбинации одноклеточного (подкожно) и объемного анализа секвенирования РНК у пациентов с РА показали, что различные субпопуляции фибробластов в выстилке и подслизистых синовиальных компартментах связаны со специфическими признаками заболевания. Маркеры выстилающих фибробластов включают подопланин (PDPN) и лубрицин/протеогликан 4 (PRG4), тогда как сублимирующие SF характеризуются высокой экспрессией THY1 и PDPN. Субпопуляции RA SF характеризуются дифференциальной экспрессией нескольких маркеров, таких как CD34, VCAM1, FAP и провоспалительных медиаторов, таких как CXCL12, CCL2 и IL6 16,17 .Более поздние исследования классифицировали фибробласты, обнаруженные в зоне синовиальной выстилки, как преимущественно ответственные за повреждение суставов, тогда как фибробласты, расположенные в подслизистом слое, экспрессируют гены, которые функционируют в отношении воспаления 18,19 . Дополнительные недавние доказательства выявили доминантное Notch-опосредованное взаимодействие периваскулярных SLSF с эндотелиальными клетками, установив позиционный градиент Thy1 hi SLSF по направлению к Thy1 low / Prg4 hi LSF и вызывая воспаление тканей 20 . Хотя эти исследования сыграли важную роль в обеспечении ценной информации о классификации субпопуляций патогенных SF и связанных с ними функций в синовиальной оболочке RA, гомеостатические переходы SF в патологические и молекулярные сети, которые ими управляют, остаются неясными.

    В этом исследовании мы стремились разделить и охарактеризовать гомеостатические и патологические функции SFs в мышиной модели 3 со сверхэкспрессией человеческого TNF ( hTNFtg ). Мы предприняли интегративный подход, объединив подкожно транскриптомные данные и данные о доступности хроматина, чтобы определить основные молекулярные переключатели, которые определяют стадию и прогрессирование заболевания от здоровой до ранней воспалительной и последующей деструктивной синовиальной ткани.Наши данные показывают раннее появление и дальнейшее распространение различных патогенных подтипов SF, характеризующихся специфическими дифференциально активируемыми путями и регуляторными сетями, исходящими из состояния предшественников, которые кажутся репрессированными в нормальной подстилающей синовиальной оболочке. Изменения, наблюдаемые в транскриптоме SFs, в высокой степени коррелировали с изменениями доступности хроматина, а вывод о клеточной траектории точно указывал на новые ключевые факторы транскрипции и гены-мишени, вызывающие распространение патогенных кластеров в определенное время и в определенных местах во время прогрессирования заболевания.Наконец, интегративный метаанализ наших данных о мышах с доступными данными о РА человека выявил высококонсервативную основную регуляторную программу транскрипции, подтвердив наш подход к моделированию и выявив набор новых биомаркеров, специфичных для РА, управляемого ФНО. Наши результаты обеспечивают солидный трансляционный потенциал для определения приоритетов новых молекулярных и клеточных мишеней, специфичных для патогенных переходов синовиальных фибробластов при РА.

    Результаты

    Мультискудный анализ

    hTNFtg мышиной модели хронического воспалительного полиартрита

    Чтобы охарактеризовать прогрессирование заболевания и точно определить, что отличает гомеостаз от патогенеза на уровне субпопуляций SF в синовиальной оболочке суставов, мы интегрировали sc-транскриптомную и хроматиновую доступность профили (рис. 1а).Наша установка включала клетки из здоровой ткани (WT, 4-недельный возраст (n=3)), мыши hTNFtg на ранней стадии заболевания с проявлением синовиального воспаления ( hTNFtg /4, 4-недельный возраст (n=3)) , и на установленной патологической стадии, демонстрирующей образование паннуса, воспаление, повреждение хрящей и костей) ( hTNFtg /8, возраст 8 недель (n = 3) (рис. 1a в Приложении). 3′-библиотеки для секвенирования мРНК отдельных клеток ( 10X Genomics) были созданы для 6667 отсортированных некроветворных стромальных клеток (Cd45 , Cd31 , Ter119 , Pdpn + ), выделенных из цельной синовиальной оболочки голеностопного сустава (рис.Рисунок 1б). Параллельно был проведен анализ отдельных клеток на доступный для транспозазы хроматин с использованием секвенирования (scATAC-seq, 10X Genomics) для определения ландшафта доступности хроматина в 6679 отдельных ядрах (фибробласты Pdpn-, Thy1+ были исключены во время гейтирования и сортировки (Suppl. Рисунок 1b). Здоровые клетки и клетки hTNFtg были объединены в каждой экспериментальной модальности, чтобы создать общую базовую линию между гомеостатическими и патогенными условиями. анализ scRNA-seq некроветворных стромальных клеток мышей hTNFtg и WT.

    (а). Репрезентативное окрашивание гематоксилином и эозином голеностопного сустава на уровне таранной кости у 4-недельных мышей WT, 4- и 8-недельных мышей hTNFtg

    (b). Стратегия гейтирования для проточного цитометрического анализа синовиальных фибробластов. Интактные клетки идентифицируют на основе характеристик прямого рассеяния (FSC-A) и бокового рассеяния (SSC-A). Мертвые клетки (Dapi), лейкоциты (Cd45+), эндотелиальные (Cd31+) и проэритробласты (Ter119+) исключали из анализа. Внутри ворот Lin- (CD45-CD31-Ter119-) фибробласты синовиальной выстилки (PDPN+, Thy1-) можно было отличить от сублимирующих фибробластов (PDPN+, Thy1+).Стратегия сортировки клеток для подкожного анализа выделена красной рамкой, тогда как стратегия сортировки клеток для Bulk RNA-seq выделена зеленой рамкой. Перициты, которые не были отобраны ни в одном из подходов, выделены черными точками (Pdpn-, Thy1+).

    Рисунок 1. Мультиомный транскрипционный и эпигенетический анализ отдельных клеток фибробластных синовиальных клеток.

    (а). Схематическое изображение экспериментального рабочего процесса. Мы собрали синовиальную ткань лодыжки от мышей WT и hTNFtg, ферментативно дезагрегировали ткань и отсортировали клетки в один гейт, представляющий фибробласты (CD45-, Ter119-, CD31-, Pdpn+).Мы профилировали клетки как с sc 3′ mRNAseq (scRNA-seq), так и с scATACseq, используя технологию 10X, и выполнили кросс-модальности (scRNA-seq-scATAC-seq), а также межвидовой интегративный анализ scRNA-seq с общедоступным RA человека. наборы данных.

    (б). Высококачественные отфильтрованные синовиальные фибробласты (SF) (n = 5903 клеток для sc-RNAseq и n = 6046 ядер для sc-ATACseq), спроецированные в пространстве UMAP и окрашенные кластером.

    (с). Характеристические графики SF, показанные на панели b, отображают нормализованные значения экспрессии (для scRNA-seq) и оценки активности (для scATAC-seq) для генов Prg4 и Thy1.

    (г). Тепловая карта, показывающая неконтролируемую кластеризацию маркерных генов scRNAseq (активированные гены по крайней мере в одной субпопуляции по сравнению с другими) в соответствии со средними масштабированными значениями экспрессии (z-оценка).

    (д). Тепловая карта, показывающая неконтролируемую кластеризацию пиков маркера scATACseq (области с повышенной доступностью по крайней мере в одной субпопуляции по сравнению с другими) в соответствии с их средними масштабированными показателями активности (z-оценка) (см. Методы).

    (ф). Тепловая карта коэффициентов корреляции Пирсона между средними масштабированными значениями экспрессии (РНК) и средними шкалированными показателями активности (ATAC) наиболее изменчивых генов, выявленных с помощью анализа scRNA-seq.

    Проверка маркерных генов основных кластеров, которые были выделены с помощью FACS, была использована для аннотирования соответствующих типов клеток (методы) и позволила предположить, что 10% секвенированных клеток/ядер представляют собой нефибробластные клетки, такие как: остеобласты ( Alpl , Bglap2 , Ostn ), хондроциты ( Chad , Clip2 ), миобласты/миоциты ( Des, Actn3 ) и сосудистые клетки (рис. Cdh5). Аннотация кластера ScATAC-seq была выполнена с использованием канонического корреляционного анализа (CCA) и позволила сопоставить идентификаторы кластеров scRNA-seq и scATAC-seq (Suppl.Рисунок 3а, б и Методы).

    Дополнительная фигура 2. Дополнительный анализ scRNA-seq некроветворных стромальных клеток, полученных из hTNFtg и синовии голеностопного сустава дикого типа.

    (а). Проекция UMAP, показывающая различные типы клеток в объединенном наборе данных RNA-seq (слева), и гистограмма, показывающая их относительную численность (справа).

    (б). Скрипичные графики, показывающие нормализованные значения экспрессии генов в различных типах клеток. (объединенный набор данных – включены все ячейки)

    (c). Гистограммы, показывающие количество генов, обнаруженных на клетку (слева), и общее количество прочтений на клетку (справа) (объединенный набор данных — включены только клетки фибробластов)

    (d).Гистограммы, изображающие относительную распространенность кластеров в объединенных данных секвенирования РНК, содержащих только фибробласты (левая панель), и графики-скрипки, показывающие нормализованные значения экспрессии для маркеров фибробластов. (объединенный набор данных – включены только клетки фибробластов)

    Дополнительный рисунок 3. Дополнительный анализ scATAC-seq некроветворных стромальных клеток, полученных из hTNFtg и синовии голеностопного сустава дикого типа.

    (а). Проекция UMAP, показывающая различные типы ячеек в объединенном наборе данных ATAC (слева), и гистограмма, показывающая процентное соотношение различных типов ячеек (справа).

    (б). Скрипичные графики, показывающие показатели активности генов для выбранных генов в различных типах клеток. (объединенный набор данных – включены все ячейки)

    (c). Левая панель: средние графики распределения прочтений вокруг TSS для образцов WT, hTNFtg/4 недели и hTNFtg/8 недель, демонстрирующие острый пик при TSS и меньший пик (справа от TSS) из-за стабильно расположенной +1 нуклеосомы. Правая панель: График, показывающий распределение размеров фрагментов с незначительной вариабельностью между образцами (WT, hTNFtg/4 недели и hTNFtg/8 недель, как указано).

    (г). Гистограммы, изображающие процент кластеров в объединенных данных ATAC-seq, содержащих только фибробласты (левая панель), и графики скрипки, показывающие оценки генной активности для маркеров фибробластов. (объединенный набор данных – включены только клетки фибробластов)

    Мы сосредоточились на 5903 и 6046 клетках/ядрах, представляющих характеристики SF в scRNA-seq и scATAC-seq соответственно (рис. 2c, 3c в Приложении). Субкластерный анализ молекулярных карт, специфичных для SF, выявил девять кластеров фибробластов: S1, S2 (a, b, c и d), S3, S4 (a и b) и S5 (рис.рис. 2г, 3г). Используя в качестве прокси классические маркеры Prg4 и Thy1 16,18,19 , мы наблюдали компартментализацию LSL (S4a, (Prg4+)) по сравнению с SLSF (S1, S2a, b, c, S3, S5 (Thy1+)) ( Рисунок 1в). Мы также отметили, что кластеры S2d и S4b, которые в основном присутствуют на стадии заболевания ( hTNFtg /4,8), экспрессируют оба гена (рис. 4 в Приложении). Кластеризация клеток на основе экспрессии всех 1716 маркерных генов scRNA-seq (, т.е. с повышенной доступностью по крайней мере в одной субпопуляции SF по сравнению с другими) выявили клеточную специфичность и общие паттерны как на уровне транскрипции, так и на уровне хроматина (рис. 1d, e). Фактически, высокие показатели коэффициента корреляции между экспрессией генов и доступностью хроматина наблюдались не только внутри кластеров, но также между кластерами и предполагали некоторое архитектурное/функциональное перекрытие между SLSF и между LSF и кластерами S2d, S4b (рис. 1f). В целом, используя комбинированный омический подход, мы могли деконволюционировать разновидности НФ.Следовательно, мы выявляем специфические паттерны экспрессии генов и связанные с ними сигнатуры доступности хроматина, которые можно использовать для дальнейшей характеристики молекулярных маркеров RA и для понимания регуляторных сетей генов, управляющих его патофизиологией (см. ниже).

    Дополнительная фигура 4. Экспрессия Prg4 и Thy1 в hTNFtg и WT SF.

    (а). Гистограммы, показывающие процент Thy1-положительных, Prg4-положительных и двойных положительных клеток SF в каждом кластере на образец для модальностей scRNA-seq (вверху) и scATAC-seq (внизу).

    (б). UMAP показывает распределение SF для объединенных наборов данных scRNA-seq (слева) и scATAC-seq (справа). Клетки окрашены для Thy1-положительных, Prg4-положительных, двойных положительных клеток SF и двойных отрицательных клеток.

    (с). Аналогичен (б), но клетки окрашены образцом происхождения.

    Карты регуляции транскрипции с высоким разрешением в гомеостатических суставах

    Сначала мы охарактеризовали специфичность экспрессии РНК популяций SF в здоровых гомеостатических суставах путем независимого изучения SF WT (рис. 2a) и путем количественного определения количества клеток, обнаруженных в образце и в кластере ( Рисунок 2б).Мы обнаружили специфические для кластера гены с повышенной экспрессией (рис. 5a в приложении), которые соответствовали установленным маркерным генам SF, и мы также идентифицировали гены, которые до сих пор не были связаны с биологией SF, вероятно, из-за их ограниченной экспрессии в нескольких специфических клетках ( Приложение Таблица 1).

    Дополнительная фигура 5. Анализ дифференциальной экспрессии (DEA) транскриптомов hTNFtg и WT SFs

    (a). (Вверху) Таблицы, суммирующие количество генов с повышающей (UP) и понижающей (DOWN) регуляцией после DEA между данным кластером и другими (между DE) для клеток WT, Tg4 и Tg8.

    (б). Тепловая карта показателей корреляции между наиболее вариабельными генами (MVG) для всех кластеров SF в WT, hTNFtg/4w и hTNFtg/8. Отдельные кластеры и образцы имеют цветовую кодировку. Высококоррелированные группы кластеров, специфичные для патологии и гомеостаза, выделены черными пунктирными линиями.

    (с). Расходящаяся гистограмма, показывающая количество повышающих (зеленый) и понижающих (красный) генов после DEA между Tg и клетками дикого типа (Intra-DE) данного кластера.

    (г). (Вверху) Таблица, обобщающая количество генов интер-внутри DE, обычно повышающих регуляцию в различных подмножествах клеток, показывающая сходство в генах, определяющих S2.d Кластеры S4.b и S4.a (пунктирная рамка) и (внизу) цирковые диаграммы, визуализирующие степень общих генов с повышающей регуляцией между этими кластерами.

    (д). Анализ функционального обогащения интра-DEG (hTNFtg против WT) для кластеров S2.d, S4.b и S4.a. Функциональные термины на тепловой карте окрашены в соответствии со статистической значимостью обогащения.

    Рисунок 2. Функциональное ремоделирование синовиальной мезенхимы между здоровыми WT и суставами, пораженными hTNFtg.

    (а). Представление UMAP распределений SF, полученных из scRNA-seq, для трех образцов отдельно (WT, hTNFtg/4 недели и hTNFtg/8 недель, как указано).Клетки окрашены кластерными идентичностями, а отмеченная область выделяет динамические изменения промежуточной (I) и выстилающей (L) субпопуляций во время прогрессирования заболевания.

    (б). Гистограмма с накоплением, показывающая относительное содержание (%) кластеров в образцах (WT, hTNFtg/4 недели и hTNFtg/8).

    (с). Точечный график выбора маркерных генов кластера, идентифицированных с помощью scRNA-seq. Цвет точки показывает интенсивность экспрессии, а размер обозначает процент клеток, экспрессирующих ген в каждом кластере и состоянии.

    (г). Точечный график выбора репрезентативных генных онтологий (ГО, биологические процессы) по кластерам/выборкам, определенным с помощью анализа функционального обогащения (см. Методы). Цвет точки показывает статистическую значимость (-Log10(Padj)), а размер обозначает процент маркерных генов кластера, обнаруженных в списке генов GO.

    S4a экспрессировал высокие уровни Prg4 (Prg4 high ) без Thy1, а также другие гены, ранее описанные как маркеры фенотипа выстилки, такие как Tspan15 , Hbegf и Htra4 Htra4 и Htra4 (рис. 2с).В суставах WT эти LSF были четко отделены от сублимирующих клеток (Thy1+, Prg4-) из-за очень ограниченного количества клеток S2d и S4b (Thy1+ Prg4+) (рис. 2a, b), результат, который устанавливает, что компартментализация Thy 1 и экспрессия Prg4 более устойчива в тканях WT. Анализ функционального обогащения показал, что, в отличие от описанного деструктивного профиля кластера выстилки при артрите 18 , в нормальных условиях ЛСФ имеют тенденцию сохранять гомеостаз тканей, регулируя реакции на окислительный стресс и связанную с ним индуцированную гибель клеток, а также гомеостаз митохондриального кальция, основного сигнального модулятора 21 (рис. 2d).

    Что касается популяций Thy1 + SLSF, мы обнаружили, что состояние транскрипции S1 отмечено экспрессией генов Smoc2, Thbs1, Vwa1 , которые кодируют матрицеллюлярные белки и корецептор BMP Rgma (рис. 2c и таблица в Приложении). 1, 2), которые указывают на сильный хондрогенный потенциал, подтвержденный активированными сигнальными путями BMP/SMAD, обнаруженными в анализе обогащения GO (рис. 2e). Экспрессия генов, связанных с метаболизмом стероидов, включая фермент превращения кортизона Hsd11d1 , обеспечивает клеткам S1 потенциальную противовоспалительную роль 22 .

    Подтипы S2 SF характеризуются общими ( Comp , Ptn , Gdf10) и дивергентными маркерными генами и функциями (рис. 2c, d и таблицы 1, 2 Приложения). В частности, популяция S2a определяется высокой экспрессией модуляторов WNT Dkk2 и Sfrp1, в соответствии с обогащением GO в WNT-опосредованных ответах, активности TGF и остеогенезе. Кроме того, специфическая экспрессия гена Ecrg4 указывает на роль S2a в регуляции процессов восстановления тканей (заживление ран) 23 .В S2b экспрессия генов коррелирует с морфогенезом суставов и репаративными процессами; напр. Osr1 регулирует Prg4 24 и играет ключевую роль в дифференцировке фибробластов 25 . Более того, маркерный ген Nr2f2 (COUP-TFII) участвует в решении клеточных судеб стволовых клеток 26 . Согласно той же линии доказательств, клеточное состояние S2c характеризуется активацией сигнального пути BMP, что предполагает участие S2c в обновлении и защите синовиальной оболочки.Роль S2c в тканевом гомеостазе также подтверждается специфической экспрессией Klf5 и Clu , участвующих в регуляции пролиферации, старения и/или ответов на окислительный стресс 27-29 . Другие сигнальные модуляторы, высоко экспрессируемые в S2c, такие как Id1 и Meox1, , связаны с повышенной экспрессией локуса p16/Ink4a 30–32 , регулятора клеточного цикла, ранее предложенного в качестве терапевтической мишени для RA 33 .

    Сигнатура экспрессии гена S3 позволяет предположить, что эти клетки управляют процессами, связанными с васкулогенезом и регуляцией иммунных ответов типа 2, что характеризуется экспрессией Pi16, который действует при боли и перекрестных помехах фибробластов/эндотелия 34 , физиологических сосудистых нормализующие модуляторы Sema3c 35 и Efemp1 36,37 , а также регулятор глюкозы и иммунорегулятора Dpp4 38 (рис. 2c, d и Suppl.Табл. 1, 2).

    Наконец, клетки S5 демонстрируют активацию путей цитокинов и хемокинов ( Ccl7 , Cxcl10, IL6 и Ptx3 ) и связаны с иммунорегуляторными функциями, включая ответ на IFN-бета/гамма и LIF, что указывает на сильную иммунорегуляторную роль в синовиальной оболочке в норме. Примечательно, что Notch4, ген, недавно выделенный в связи с его ролью в управлении идентичностью SF в периваскулярном/сублинирующем слое артритной синовиальной оболочки 20 , также экспрессируется в нормальных условиях исключительно в кластере S5 (рис.Табл. 1, 2).

    В целом, анализ SF в наивных условиях выдвигает на первый план ранее недостаточно изученное функциональное разнообразие, лежащее в основе гомеостаза синовиальной оболочки.

    Развитие воспалительного артрита связано с транскрипционным ремоделированием популяций и функций SF

    Затем мы попытались проанализировать процессы, лежащие в основе появления и поддержания TNF-индуцированных патологических состояний SF. Дифференциальный анализ численности выявил субпопуляции клеток, обогащенных болезнью: S2d и S4b.Примечательно, что доля клеток S2d увеличилась с почти неопределяемого уровня (2%) в здоровых условиях до 25% в суставах hTNFtg (рис. 2а, б). Точно так же класс S4b, который практически отсутствовал у WT (0,17%), постепенно становился более очевидным в процессе артритогенеза (9,72% и 14,08% при раннем и развившемся артрите соответственно) (рис. 2а, б). Сигнатура смешанной экспрессии Prg4 и Thy1 (Prg4+Thy1+), которая характеризует эту «промежуточную» группу клеток, является, таким образом, сильным маркером болезненного состояния, которое наблюдается в основном в условиях hTNFtg (рис. 1c, 2a, Suppl.Рисунок 4).

    Фактически, корреляционный анализ наиболее изменчивых генов (MVG) (рис. 5b в Дополнении) кластеров SF выявил поразительное перекрытие профилей транскрипции Prg4 High S4a SF и промежуточных субпопуляций S4b и S2d SF, которые уже было предложено на основании паттернов выбранных репрезентативных маркерных генов и GO (см. рис. 2c, d). Показатели корреляции были выше между клетками hTNFtg , что указывает на острое и стабильное изменение сигнатур экспрессии этих SF после начала артрита (Suppl.Рисунок 5б). Анализ внутрикластерной дифференциальной экспрессии (DEA) между hTNFtg и клетками дикого типа определил, какие изменения произошли после начала заболевания и как они были в основном обнаружены в SF S2d, S4a и S4b (рис. 5c в Приложении). Значительное пересечение кластерных генов и генов-маркеров заболеваний (inter-intra DE) для промежуточных и выстилающих кластеров предполагает их синергизм и указывает на то, какие гены, вероятно, необходимы для управления патогенными функциями (рис. 5c-e в приложении, таблица 2 в приложении и см. ниже). ).Прирост в промежуточных клетках был компенсирован уменьшением пропорционально количеству других типов клеток S2a, b, c, S3 и, в меньшей степени, S1 и S5 (рис. 2а, б), и эти кластеры показали более однородную сигнатуру. и меньше генов DE между WT и hTNFtg , что лежит в основе их общих и стабильных функций в здоровых и больных суставах (Suppl. Figure 5b, c).

    Анализ генов, специфичных для общего заболевания, с повышенной экспрессией (Приложение, рис. 5a справа, c и d), показывает, как они могут управлять обширной перестройкой функций и свойств синовиальной оболочки во время артрита (Приложение.рис. 5e и см. ниже). Например, клетки S2d экспрессируют очень важные гены патологии суставов (рис. 2c, d), в том числе: компонент ECM Fbln7 39 , который, как недавно было показано, регулирует отложение кальция в пораженных тканях почек, что указывает на его роль в ремоделировании кости при артрите. 40 ; матрицеллюлярный белок Thbs4 ; ремоделировщик сосудов Cthrc1 , который также был предложен в качестве маркера эмбриональных предшественников SF, фиброзно-хрящевых клеток энтезиса 41 и фиброзных фибробластов легких 42 , и в настоящее время тестируется в качестве диагностического маркера РА (https: //клинические испытания.gov/ct2/show/NCT04092244). S2d SF также экспрессируют Lrrc15 , недавно идентифицированный маркер раковых ассоциированных фибробластов (CAFs) и активированных фибробластов 43,44 . Наконец, экспрессия Dkk3 , разного члена семейства DKK, который, возможно, регулирует TGFbeta скорее, чем путь WNT 45, связывает транскрипционное состояние мышиного S2d с ранее описанным кластером SF SC-F3 (DKK3+) человека 19. Соответственно, мы находим, что биологические процессы, характеризующие S2d SF, простираются от регуляции иммунного и окислительно-восстановительного ответа до определения судеб клеток и ремоделирования ECM, что указывает на мультипотентную транскрипционную сигнатуру.В этом отношении мы выделяем фактор транскрипции Runx1 (TF) как выдающийся потенциальный регуляторный ген, высоко экспрессируемый в клетках S2d. Хотя Runx1 в основном участвует в гематопоэзе и в детерминации/дифференцировке из хондропрогениторных клеток в хондрогенную линию ,46,, он также может функционировать как регулятор перехода стромальных клеток из фибробластов в активированные миофибробласты ,47,.

    Маркерные гены S4b, в том числе Mki67 , Pdgfa , Birc5 , Aqp1 предполагают патогенные функции, связанные с процессами пролиферации, регуляции клеточного цикла и апоптоза (рис.Рисунок 6а). Экспрессия генов, связанных с цитоскелетом, таких как Acta2, также указывает на то, что клетки S4b проявляют свойства, сходные со свойствами миофибробластоподобного состояния активированных SF. Наконец, обнаружение C1qtnf3 адипокина и других хемокинов, таких как Cxcl5 , а также молекул адгезии, таких как Cdh23 , подтверждает идею о том, что эти клетки, вероятно, в значительной степени способствуют воспалительному процессу при артрите (рис. 2c, d).

    Дополнительная фигура 6. Анализ клеточного цикла SF от мышей hTNFtg и WT.

    (а). Характеристические графики, показывающие нормализованные значения экспрессии генов, связанных с пролиферацией клеточного цикла.

    (б). Проекция UMAP, изображающая фазу клеточного цикла для каждой клетки в объединенном наборе данных (см. Методы).

    (с). Гистограммы, показывающие процентное содержание клеток в каждом кластере (на образец), принадлежащих к фазе G1 (слева), S (в центре) и G2/M (справа).

    Анализ S4a, выстилающих SF, показал, что во время TNF-опосредованного артрита они сохраняют некоторую идентичность маркерного гена гомеостатических LSF, но также демонстрируют расширение разнообразия их транскриптома, что указывает на то, что их репаративные функции могут быть затронуты после начала заболевания.Действительно, мы обнаружили маркеры воспалительной реакции ( Ccl2, Ccl5, Hmox1 Saa3 ), презентации антигена класса I ( h3-K1, B2m, h3-Q7 ) и ремоделирования ВКМ ( Mmp3, Timp1, Cd44 ) (рис. 2c, d), в соответствии с предыдущими сообщениями о артритных LSF 18,19 . Примечательно, что тщательный субкластерный анализ кластера S4a показал наличие двух групп клеток (подкластеры hS4a (гомеостатические) и iS4a (воспалительные)), где экспрессия и функции гомеостатических генов сведены к минимуму во время распространения болезни, в то время как параллельно наблюдается возникновение и распространение агрессивного воспалительного состояния (Suppl.Рисунок 7 и Приложение. Таблица 3).

    Дополнительный рисунок 7. Субкластерный анализ населения облицовки выявил два отдельных подкластера.

    (а). Представление UMAP идентифицированных подкластеров облицовки. Клетки, принадлежащие к гомеостатической группе, окрашены в синий цвет, а клетки, принадлежащие к воспалительной группе, окрашены в красный цвет. Графики UMAP повторной кластеризации также показаны на вставке.

    (б). Гистограмма, показывающая относительное содержание клеток в каждом субкластере в здоровом состоянии и при прогрессировании заболевания.

    (с). Графики UMAP Feature для выбранных генов, показывающие дифференциальные модели экспрессии между двумя субкластерами.

    (г). Точечный график общих и специфических обогащенных ГО биологических процессов в двух субкластерах.

    Чтобы определить, отражается ли функциональная специализация SF, описанная выше, в архитектуре тканей суставов, мы пространственно локализовали экспрессию некоторых репрезентативных кластер-специфических маркерных генов в здоровых суставах и суставах с артритом с помощью иммунофлуоресценции (IF) и конфокальной микроскопии.S2a/b-ассоциированный маркер Gdf10 и маркер S2a Comp были обнаружены в Thy1-экспрессирующих мезенхимальных клетках, непосредственно примыкающих к внешнему клеточному слою выстилки ближе к хрящу (рис. 8a в Приложении). Comp был также обнаружен на хондроцитах суставного хряща. Маркер S5 Notch4 был ограничен меньшей субпопуляцией Thy1 + SLSF в непосредственной близости от внутреннего компартмента синовиальной оболочки (Suppl. Figure 8a). Кроме того, CD44 и Ki67, маркеры «промежуточных» кластеров S4b и S2d, увеличивающих распространение болезни, обнаруживают частичную совместную локализацию с экспрессирующими Thy1 фибробластами SL (Suppl.Рисунок 8b/e). В частности, определена специфическая пространственная тенденция для S2d и S4b SF в виде маркеров Wisp2, Prg4, Mki67 и Cd44, локализованных в областях на границе между паннусом и суставной костью и в ткани паннуса, проросшей в хрящ и кость. во время воспаления. Напротив, кластеры S5 и S2 исключены из областей костной эрозии и ограничены тканью паннуса, окружающей сустав, совместно локализованным с экспрессией Thy1 (Suppl. Figure 8a). Наконец, Prg4, экспрессирующий SFs, подтвердил локализацию субпопуляции выстилки S4a, непосредственно прилегающей к суставному хрящу и кости, и мы наблюдали in situ экспансию и инвазивную функцию промежуточных клеток при установившемся болезненном состоянии (Suppl.Рисунок 8в).

    Дополнительная фигура 8. Пространственное распределение репрезентативных маркеров кластеров sc SFs в инвазивном паннусе, образованном в голеностопных суставах hTNFtg при установленном состоянии артрита.

    Репрезентативный конфокальный срез (n=3 мыши на генотип), изображающий экспрессию маркерных генов, идентифицированных при кластеризации SF. Пунктирная желтая линия на всех изображениях hTNFtg указывает на сублинейную локализацию на уровне пересечения паннуса (р) и кости (б), пунктирные линии на каждом снимке и выделяет деструктивный паннус, проникший в таранную кость кости голеностопный сустав.Репрезентативные конфокальные изображения срезов голеностопного сустава на уровне таранной кости 4-недельных мышей дикого типа, верхних панелей и 8-недельных мышей hTNFtg (n = 3 мыши на генотип). Маркерные гены и связанные с ними субпопуляции указаны на каждой панели.

    (а)., (г). Маркер S2c Clu демонстрирует хорошо распределенную экспрессию в сублинейном компартменте, определяемую экспрессией Thy1. Маркер S2a и b Gdf10, выделенный зеленым, демонстрирует экспрессию в основном в провоспалительном паннусе, окружающем сустав. Маркер S5 Notch4 демонстрирует периваскулярную локализацию в здоровой синовиальной оболочке и расширение в пораженном артритом голеностопном суставе, совмещенное с сублинейкой Thy1+.

    (б)., (д). Cd44 (зеленый) и Comp (белый) коэкспрессируются в ограниченной субпопуляции S2d в здоровом суставе, однако обе расширяющиеся артритические субпопуляции S2d и S4b, на которые указывает совместное окрашивание Cd44 с Ki67, локализованы по краям паннуса как внутри, так и внутри сустава. снаружи кости.

    (в), (е). Prg4 (зеленый), маркерный ген для субпопуляции выстилки S4a, демонстрирует исключительную экспрессию в самом внешнем слое SF здорового сустава и в суставе hTNFtg, его экспрессия увеличивается и в основном обнаруживается в инвазивном паннусе в кости, но также и в интерфейсном паннусе. костная зона.Все масштабные линейки, 50 мкм, b: кость, p: паннус.

    В совокупности эти результаты составляют подробные молекулярные, функциональные и анатомические карты, отображающие динамические и разнообразные эффекты TNF на развитие и прогрессирование патогенных состояний SF.

    Прогностические маркеры воспалительной экспансии SF при TNF-опосредованном артрите

    Чтобы проверить, можно ли использовать наши результаты scRNA-seq для предсказания надежной экспрессии генов маркера артрита в тканях, мы выполнили массовую секвенирование РНК на отсортированных LSF и SLSF.Популяции LSF (CD31Cd31-, CD45-, Ter119-, CD90-, Pdpn+) и SLSF (CD31-, CD45-, Ter119-, CD90+, Pdpn+) WT, hTNFtg 4- и 8-недельных мышей были разделены и показали четкое разделение клеток WT и hTNFtg (рис. 9a в Приложении). DEA выявил больше изменений в экспрессии генов между выстилающими и сублинейными SF у здоровых животных по сравнению с аналогами hTNFtg (Suppl. Figure 9b, top, Suppl. Table 4), снова предполагая, что SF имеют тенденцию терять свою острую бимодальность (выравнивание vs сублинейный) характер в артритных тканях.Рассчитав FC между LSF и SLSF для маркерных генов, идентифицированных с помощью scRNA-seq, мы подтвердили, как гены S4a соответствуют сигнатуре состояния выстилки, в то время как гены S2d и S4b более равномерно экспрессируются в обоих состояниях, а остальные кластеры, как правило, определяются генами. активируется в состоянии SLSF (рис. 9d в Приложении). Подтверждающе, мы обнаруживаем, что больше генов sc кластеров S4a обнаруживается как массовые маркеры LSF, больше генов, представляющих S5, S2b и S2b, являются массовыми маркерами SLSF, в то время как сбалансированное количество маркеров S2d и S4b обнаруживается в массовых LSF и SLFs DEG. списки (доп.Рисунок 10a), и мы выделяем некоторые репрезентативные гены для SL, промежуточных (I) и L-клеток (Suppl. Figure 10b). Наконец, мы нашли диагностические гены-кандидаты, которые теряют или приобретают различия между LSF и SLSF во время болезни, и предполагаем, что их можно использовать для проверки тяжести заболевания путем сортировки SF из биопсий суставов с последующей количественной оценкой экспрессии генов с помощью количественной ПЦР (Приложение, рисунок 10c). .

    Дополнительная фигура 9. Массовый анализ секвенирования РНК отсортированных SF из голеностопных суставов мышей WT и hTNFtg (1/2).

    (а). График PCA образцов массового секвенирования РНК. Обратите внимание, как образцы сгруппированы по горизонтали как дикий тип (слева) и трансгенные (справа) и по вертикали как сублинейные (вверху) и лайнерные (внизу)

    (б). Графики вулкана, показывающие количество и характеристики генов, регулируемых вверх и вниз, для сравнений WT L с WT SL, Tg4 L с Tg4 SL и Tg8 L с Tg8 SL

    (c). Диаграмма рассеяния, показывающая степень перекрытия (и корреляцию в FC) для выстилающих, промежуточных и сублинейных специфических DEG между scRNA-seq и объемной RNA-seq.Обратите внимание на более низкие числа в образцах hTNFtg.

    (г). Слева: прямоугольные диаграммы, показывающие значения Log2FC (сравнения L и SL) в каждом образце объемных данных RNA-seq для маркерных генов каждого кластера в наборе данных scRNA-seq. Справа на графиках с погрешностями показана стандартная ошибка значений Log2FC для 3 выбранных маркерных генов на кластер. Результаты показаны для каждого образца, как указано.

    Дополнительная фигура 10. Массовый анализ секвенирования РНК отсортированных SF из голеностопных суставов мышей WT и hTNFtg (2/2)

    (a).Доли (%) маркерных генов (обнаруженных с помощью scRNA-seq для определенного кластера), которые также регулируются с повышением в объемной RNA-seq для выстилающих (оттенки красного) и сублимирующих клеток (оттенки синего).

    (б). Тепловая карта масштабированных нормализованных подсчетов, полученных с помощью массового анализа РНК-seq для маркерных генов sc, описанных на фигуре 2C (для подкладки (SL), промежуточной (I) и подкладки (L)).

    (с). Тепловая карта, показывающая различия между образцами (сравните WT с hTNFtg) в значении FC между выстилающими (L) и сублимирующими (SL) клетками, обнаруженными в массиве РНК-seq.В полях выделены гены-кандидаты, которые можно использовать для ОТ-ПЦР для проверки статуса заболевания.

    Развитие патологии артрита зависит от активированных эпигеномных состояний в SFs

    Чтобы идентифицировать патогенные молекулярные главные переключатели, которые остаются репрессированными в здоровых суставах и активируются при артрите, мы также проанализировали данные scATAC-seq, чтобы найти специфичный для состояния и типа клеток хроматин. сигнатуры и изучить, какие TF и ​​гены-мишени контролируются на эпигеномном уровне. Паттерны доступного хроматина повторяют значительное расширение субпопуляций SF S2d и S4b при прогрессировании заболевания (рис. 3а, б).Более того, выполнив двухуровневый анализ дифференциальной доступности (DA), мы охарактеризовали, как функциональные выходы SF контролируются вариабельным репертуаром открытых областей хроматина (OCR). Сначала мы установили, какие геномные области приобрели или потеряли прочтения scATAC-seq между данными подтипами SF (межкластерный анализ) (рис. 3c), а затем какие локусы изменили свой статус (открытие или закрытие) в данном кластере при артрите ( hTNFtg 4 нед. и hTNFtg 8 недель в совокупности) по сравнению со здоровыми (WT) SF (внутрикластерный анализ) (рис. 3d).Мы отметили особенно повышенное количество специфичных для клеток и подтипов OCR в промежуточных клетках S2d, S4b и выстилке S4a, а также поразительное увеличение доступности ДНК на 27,9 и 49,8% в локусах, специфичных для S2d и S4b (рис. 3d). Наши данные подтверждают идею о том, что резкая перестройка хроматина лежит в основе экспансии этих типов клеток, и мы предполагаем, что идентифицированные области могут служить новыми сигнатурами доступности для конкретных заболеваний (рис. 3c-d), и они могут обеспечивать новые механистические связи с тем, что/ как ключевые регуляторные гены контролируют артрогенез (см. ниже).

    Рисунок 3. scATAC-seq резюмирует ремоделирование синовиальной мезенхимы между здоровыми WT и суставами, пораженными hTNFtg артритом.

    (а). Представление UMAP SF в трех разных выборках (WT, hTNFtg/4 недели и hTNFtg/8 недель, как указано). Клетки окрашены в соответствии с идентичностью кластеров, а отмеченная область выделяет структурные динамические изменения промежуточной (I) и выстилающей (L) субпопуляций во время прогрессирования заболевания.

    (б). Гистограмма с накоплением, показывающая относительное содержание (%) кластеров в образцах (WT, hTNFtg/4 недели и hTNFtg/8 недель).

    (с). Верхняя панель: Схематическое представление процедуры обнаружения пика маркера. Нижняя панель: тепловая карта, показывающая кластеризацию в соответствии с z-показателями нормализованной доступности для 50 636 маркерных пиков в субпопуляциях SF и болезненных состояниях (WT, hTNFtg).

    (г). Верхняя панель: Схематическое представление определения пика маркера, специфичного для заболевания. Нижняя панель: слева, гистограммы с накоплением отображают пропорции пиков стабильных (общих для WT и hTNFtg) и hTNFtg-специфических маркеров; в середине: тепловая карта, показывающая кластеризацию в соответствии с z-показателями нормализованной доступности для 7799 пиков маркеров, специфичных для заболевания (hTNFtg-up-regulated) в субпопуляциях SF для клеток WT и hTNFtg.Справа: диаграмма Barchart, изображающая количество пиков маркеров, специфичных для заболевания (областей открытия болезни) на кластер.

    (д). Тепловая карта, показывающая z-показатель нормализованной доступности и интегрированной экспрессии генов 22 742 связей между пиками и генами в субпопуляциях WT и hTNFg SF. Верхняя часть, связи между пиками и генами, которые являются общими для болезненных состояний. Средняя часть, связи между пиками и генами, уникальные для клеток hTNFg. Нижняя часть, связи между пиками и генами, уникальные для клеток WT.

    (ф). Гистограмма с накоплением, показывающая количество маркерных генов, специфичных для заболевания (описанных в e, средняя часть), обнаруженных исключительно в данных scATAC-seq (красный), общих для разных модальностей (фиолетовый) и обнаруженных исключительно в данных scRNA-seq (серый).

    (г). Гистограмма, показывающая количество областей на гены с улучшением доступности, обнаруженным при заболевании для генов, обнаруженных только в данных scATAC-seq (красный), или показывающая комбинированную повышающую регуляцию в scATAC-seq и scRNA-seq (фиолетовый).

    Чтобы интерпретировать повышенную экспрессию специфических для заболевания генов, охарактеризованных выше, и определить соответствующие биологические эффекты глобального повышения активности РНК-полимеразы II и доступности сайтов связывания TF, мы определили связи между пиками и генами (рис. 3e и методы). ).Многие регуляторные звенья генов (гены, связанные с данными OCR) оказались консервативными в разных условиях (рис. 3с) и не показали заметных изменений на уровне хроматина; этот вывод согласуется с наблюдением, что подавляющее большинство OCR остаются стабильными (рис. 3d, слева). Напротив, для OCR, которые изменяются при заболевании, мы выявляем 1786 и 8807 ассоциаций регионов/генов, которые отличают здоровые и hTNFtg SF (рис. 3e). Многие гены с повышенной экспрессией во время заболевания демонстрируют параллельное увеличение доступности, особенно для промежуточных клеток (S2d и s4b), где до 40% генов были активированы в hTNFtg SF, согласно scRNA-seq, а также показали открытие хроматина по крайней мере в одном из связанных OCR (рис. 3f, 61 из 151 гена для кластера S4b).Фактически, для генов, обычно проявляющих увеличение scRNA-seq и scATAC-seq, мы обнаруживаем открытие хроматина в большей пропорции связанных с ними регуляторных областей по сравнению с генами, которые не экспрессируются дифференциально и демонстрируют только открытие хроматина (рис. 3g). Мы пришли к выводу, что ключевые драйверные гены патогенеза надежно активируются, когда клетки одновременно открывают минимальный набор связанных регуляторных областей.

    Регуляторные сети генов, контролирующие гомеостатические и патогенные функции SF

    Чтобы определить, какой TF может контролировать регуляторные области клеточного типа или заболевания и связанные с ними гены, мы провели анализ мотивов ДНК (рис.Рисунок 13а). Во-первых, мы выделяем специфические для кластера группы TF, которые, вероятно, сохраняют разнообразие функций SF (рис. 13 в Приложении). Например, семейство TF C/EBP, участвующее во многих процессах, включая дифференцировку клеток, воспаление, старение и т. д. (обсуждается в 48). ,49 ) связаны с кластером S5, тогда как семейство GATA TFs, которые регулируют переход дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (обсуждается в 50 ), связано с S2b. Напротив, промежуточные субпопуляции S2d и S4b связаны с Nfatc, который, как известно, играет центральную роль в ремоделировании костей и суставов во время патогенеза РА 51 , а кластеры S4a и S4b связаны с комбинацией TF, включая медиаторы ремоделирования хроматина Smarcc1. , Bach2/2 и провоспалительные эффекторы Junb/d, Rel и Nfkb (рис. 4а, Доп.Рисунок 13а). Сайты связывания TF (TFBS), которые появляются в больных клетках (в пределах пиков, которые оказались более доступными в hTNFtg SF), выявили Rel, Nfkb, Junb/d и Runx1 TFBS (рис. 4a). Мы подтвердили это открытие, сделав вывод о показателях совместной доступности регуляторных регионов, смоделированных для каждой клетки, с использованием cisTopic 52 (приложение, рисунок 14). Анализируя агрегированное пространство WT- hTNFtg , мы определили 12 тем, которые показывают различные вероятности вклада вдоль SF (Suppl.Рисунок 14б, в). В частности, тема 12 соответствует субпопуляции S4a, тема 5 соответствует субпопуляции S4b, а тема 8 соответствует субпопуляции S4b и S2d (рис. 14c, d в Приложении). Анализ мотивов был применен к областям, определяющим эти темы, и подтвердил, что промежуточные состояния и состояния подкладки являются управляется главными регуляторами, включая Klf, Dlx, Creb3, Runx1 и Nfkb (Рисунок 14e в Приложении).

    Рис. 4. Интегративный анализ scATAC-seq и scRNA-seq позволяет сделать вывод о предполагаемых программах регуляции артрита.

    (а). Тепловая карта, показывающая кластеризацию мотивов TF в соответствии с P-скорректированными значениями (оценки доступности мотива) (см. Методы) и отображаемая для здорового и болезненного состояния (WT, hTNFtg, как указано). Анализ обогащения мотивов был выполнен в пределах пиков маркеров, специфичных для заболевания, изображенных на рисунке 3d (правая панель). Цвет обозначает величину обогащения (-log10 (скорректированное значение P), гипергеометрический тест).

    (б). Тепловая карта, показывающая среднюю активность мотива в субпопуляциях и образцах SF (WT: wt-4w, hTNFtg/4 недели: tg-4w и hTNFtg/8 недель: tg-8w, как указано), выраженная в виде z-показателей отклонения (chromVar).Показанные регуляторы представляют собой все TF, для которых экспрессия гена положительно коррелирует с доступностью мотива TF по крайней мере в одном кластере (корреляция Пирсона> 0,5, значение с поправкой на P <0,05).

    (с). Точечный график экспрессии положительных регуляторов TF показан на (b). Цвет точки показывает интенсивность экспрессии, а размер обозначает процент клеток, экспрессирующих ген в каждом кластере и состоянии.

    (г). Скрипка Графики показателей сигнатуры генов в субпопуляциях SF и болезненных состояниях (WT, hTNFtg, как указано).Генные сигнатуры Ar и Runx1 состоят из 23 и 183 регулируемых генов соответственно. Гены-мишени демонстрируют значительно повышенную экспрессию в сублимирующих клетках (Ar) или промежуточных и выстилающих клетках (Runx1) и связаны с дифференциально доступными пиками между болезненными состояниями, которые обогащены мотивами Ar или RunX1.

    Мы определили истинные «положительные регуляторы TF», установив, какие TF демонстрируют высокую корреляцию между доступностью мотива и экспрессией мРНК TF при разрешении одной клетки 53 .Наиболее девиантные ТФ были обнаружены в расширяющихся промежуточных и выстилающих кластерах (S2d, S4b, S4a) и в меньшей степени в субпопуляции S5 (рис. 4б). Хотя мы видим стабильные высокие показатели отклонения для подмножества TF, регулирующего кластер выравнивания Prg4 high ( Dlx, Lhx и Lmx), мы подчеркиваем заметные изменения в программах регуляции TF (регулонах) во время прогрессирования заболевания для промежуточных и выравнивающих клеток. S4a, S4b и S2d (сравните здоровые суставы с ранними и установившимися болезненными состояниями), которые управляются с помощью ТФ Nfkb, Rela, Relb, Rel и Runx1 (рис. 4b и Приложение.Рисунок 13б). Хотя сублинейные кластеры Thy1+ показывают более низкие показатели отклонений и менее динамичные изменения, мы отмечаем, что они контролируются с помощью Klf , Cebpd , Ar и Nr3c1. Мы подтвердили эти результаты, проверив, что основные показатели экспрессии TF и ​​генов, которые они контролируют (регуляторные сети генов – GRN), соответствуют образцам отклонения мотива (рис. 4c, d и таблица 5 в Приложении).

    Определенная траектория дает патогенные SF в пораженных суставах

    Затем мы задались вопросом, какие клетки вызывают возникающие состояния S2d, S4b и S4a SF при заболевании и какие транскрипционные переходы происходят во время прогрессирования артрита.Мы выполнили анализ клеточных траекторий, применив набор инструментов scVelo 54 (рис. 5а и рис. 15а в приложении), и проследили клетки вдоль основного марковского процесса, чтобы определить их соответствующее латентное время. Эта процедура позволила определить правдоподобные корневые ячейки и конечные точки, а также наиболее вероятный путь, соединяющий их (рис. 5а, рис. 15а, б в приложении). Корневые свойства были в основном обнаружены в клетках состояния S2b, хотя клетки в кластерах S5, S4b, S1 и S3 также проявляли корневой потенциал (Suppl.Рисунок 15б). Независимо от происхождения клетки переходили через S2b, S2d, S4b (рис. 5а) и всегда заканчивались в области S4a (рис. 15b в приложении). Независимые методы прогнозирования траектории неизменно обнаруживали континуум S2b в сторону состояний S2a, S2d, S4b и S4a и подтверждали существование патогенной ветви (рис. 15c в приложении), которая соответствует наблюдаемому расширению лежащих в основе кластеров SF во время болезни (см. рис. 2b). ). Мы предположили, что пролиферативные события могут объяснить прирост промежуточных клеток.Действительно, подмножество клеток S4b, примыкающих к S4a, показало активацию генов Cdk1 и Ccnb1 (рис. 6a в приложении) и преимущественную экспрессию маркеров фазы G2/M (рис. 6b, c в приложении), что указывает на то, что пролиферация может объяснить, по крайней мере, частично повышенное обилие вышеупомянутых клеток у мышей hTNFtg .

    Рисунок 5. Вывод транскриптомных и открытых траекторий хроматина синовиальных фибробластов, вызывающих артрит в суставах.

    (а). Представление UMAP анализа скорости РНК с выделением клеточных переходов и динамических отношений между кластерами SF i.На левой панели показаны большие показатели скорости РНК и четко определенное направление траектории в патогенной ветви (пунктирный квадрат), состоящей из промежуточной (I, S2.d и S4.b) и воспалительной выстилки (L, iS4.a, см. Приложение Рисунок 7) кластеры, обнаруженные в клетках hTNFtg. На правой панели показаны направления и амплитуда предполагаемой траектории, наложенные на график UMAP с разрешением образца, с подробным описанием положения образцов WT и hTNFtg (4, 8 недель).

    (б). Слева: тепловая карта, отображающая значения FC между кластерами (слева) в соответствии со значениями FC внутри кластера (Tg vs WT) для 849 генов, демонстрирующих как кластерную специфичность (маркерный ген по крайней мере одного из представленных кластеров), так и заболевание. связанные изменения (tg против WT) (двоичные значения используются для обозначения повышающей регуляции (1, оранжевый) или понижающей регуляции (-1, фиолетовый) этих генов в сравнении внутрикластерных Tg и Wt, см. Методы).Обратите внимание на чрезмерное представительство генов, экспрессируемых в патогенной ветви. Справа: тепловая карта, показывающая z-показатели для 107 генов, полученные из межвнутренних генов DE (изображенных слева) с генами правдоподобия, предсказанными scVelo и полученными из (а). Клетки hTNFtg основной траектории (см. приложение, рис. 15b) ранжировали в соответствии со значениями латентного времени, полученными, когда клетку S2.b устанавливали в качестве корня траектории. Гены были сгруппированы в соответствии с z-показателем, чтобы выявить последовательность переключений экспрессии генов, наблюдаемых в процессе

    (c).Анализ траектории scATAC-seq (обведен черной сглаженной стрелкой), который резюмирует существование патогенного процесса, развивающегося через кластеры S2.d – S4.b – S4.a. Цвет указывает клеточную судьбу на предполагаемой траектории.

    (г). Тепловая карта, показывающая интегрированную активность экспрессии генов (левая панель) и отклонение мотива TF (правая панель) положительных регуляторов TF, описанных на рисунке 4b, вдоль псевдовисочной оси (слева направо, черные стрелки) в S2.b/S5 – S2. .ветвь a – S2.d – S4.b – S4.a, определенная в (c). Обратите внимание, как экспрессия гена TF значительно коррелирует с отклонением мотива TF по клеточной траектории.

    В соответствии с зависимостью нашей мышиной модели артрита от TNF и результатами анализа скорости РНК мы обнаружили высокие показатели активности для «реакции на TNF» для некоторых из предполагаемых начальных состояний, таких как S2b и S5, а также для расширенного S2d, Кластеры S4a и S4b (рис. 15d в Приложении, верхняя панель). Интересно, что S2b проявляет транскрипционную близость к сигнатуре Notch4+ S5 (Suppl.Figure 15d, нижняя панель), подтверждающие и дополняющие недавние доказательства, которые указывают на участие передачи сигналов Notch4 в приписывании периваскулярной идентичности и примировании транскрипционных сигналов SFs во время аутоиммунного артрита 20 .

    Чтобы понять потенциальные функциональные отношения в предполагаемом клеточном процессе, мы реконструировали динамику транскриптома в свете статуса DE и положения клеток в предполагаемом континууме. Во-первых, мы сосредоточились на подмножестве генов, демонстрирующих специфичность как к кластеру, так и к заболеванию.Было показано, что 849 генов, выделенных из 2322 межкластерных генов DE (рис. 11а в приложении и таблица 6 в приложении), в основном затрагиваются при переходе клеток в промежуточное (S2d и S4b) и патологически-выстилающее состояния (S4a) (рис. 5б). 107 генов, которые также были идентифицированы scVelo как движущие силы процесса дифференцировки благодаря их оценке генов с высокой вероятностью (рис. 11b в приложении и таблица 6 в приложении), были сертифицированы как играющие решающую роль в прогрессировании заболевания (анализ GO, (приложение). .Рисунок 11b и Приложение. Таблица 7)). Распределение этих генов по трем основным категориям — ранняя активация, промежуточная активация и поздняя активация, основанная на результатах иерархической кластеризации оценок экспрессии генов, выявила структуру паттерна транскрипции, управляющего клеточными изменениями от начального до конечного состояния. Рисунок 5b) с такими генами, как Runx1 , Cd44 , Tnfaip3 и Tnfaip 6, Icam1 или Inhba (Suppl.Таблица 6).

    Дополнительный рисунок 11. Дополнительный анализ DE

    (a). Справа: тепловая карта, отображающая значения межкластерного FC для 2322 генов, отображающих кластерную специфичность (маркерный ген по крайней мере одного из представленных кластеров). Слева: тепловая карта, изображающая объемные значения FC RNA-seq для этих генов (см. Методы). Образцы показаны индивидуально. Обратите внимание на чрезмерное представительство генов, экспрессируемых в выстилающих клетках в соответствии с объемной последовательностью РНК в кластере sc S4.a, и обогащение генов, экспрессируемых в сублинейных клетках, в соответствии с общей последовательностью РНК в гомеостатических кластерах S5, S2.а и S2.б. Напротив, кластеры S2.d и S4.b определяются генами, а не DE, между компартментами соединения в соответствии с объемной последовательностью РНК (см. Дополнительную фигуру 10a для количественной оценки).

    (б). Вверху: диаграмма Венна, показывающая степень перекрытия (107 генов) между интер-интра DEG и генами hTNFtg вероятности scVelo для кластеров пути траектории, описанного на рисунке 5. Внизу: тепловая карта, показывающая кластеры, полученные после анализа функционального обогащения. Обратите внимание на совместную кластеризацию патогенных (S2.г, С4.б, С4.а) функции клеток.

    Клеточный путь был также подтвержден открытыми данными хроматина (вывод траектории из scATAC-seq 55 ) и псевдовременным упорядочением клеток, повторяющих на эпигенетическом уровне патогенные переходы, наблюдаемые с помощью scRNA-seq (рис. 5c). Затем мы выдвинули гипотезу о том, что положительные регуляторы, которые проявляют повышенную активность вдоль оси S2b/S5-S4a, необходимы для регуляции генов артрита, и мы подтвердили с помощью корреляционного анализа между экспрессией гена TF и ​​соответствующей доступностью мотива, какие TF управляют дифференцировкой во время патогенности.Действительно, в соответствии с вышеприведенным анализом регулона мы обнаружили, что Runx1 обозначает «переключатель», активирующий экспансию и развитие специфических для заболевания субпопуляций S2d, S4b и S4a, и непосредственно управляет 27 из 107 генов, которые мы определили как важные для атерогенности (Suppl. Таблица 5), в то время как ТФ, такие как Rel, Nfkb2, Dlx3, Bach2, являются ключевыми эффекторами этого процесса (Рисунок 5d). Вместе эти результаты предполагают, что экспансия ветви S2b-S2a-S2d-S4b-S4a при экспрессии TNF управляет развитием артрита и влияет на выбор клеточной судьбы через специфические наборы генов, индуцированных патогенезом.

    Общие транскрипционные модули контролируют SF при РА человека и мыши

    hTNFtg воспалительный артрит

    Мы объединили ранее полученные данные scRNAseq из синовиальных биопсий пациентов с РА 16,17,19 (H) с нашей hTNFtg scRNAse (M) (подробнее см. Методы). Мы обнаружили, что клетки обоих видов особенно хорошо выравниваются в недавно определенном пространстве UMAP (рис. 6а, приложение, рис. 16а), а непредвзятая кластеризация на основе графа выявила семь (h2-H7; M1-M7) субпопуляций (рис. 6а, Доп.Рисунок 16а). Тепловая карта корреляции MVG между кластерами человека (H) и мыши (M) выявила значительное сходство в программах экспрессии SF у двух видов, хотя для кластера 2, который содержит в основном SLSF человека и лишь несколько клеток мыши, полученных из SLSF, которые мы описали выше. (Рисунок 6б). Популяции мышиных SLSF S1, S2a-c, S3 и S5 расположены преимущественно в кластерах 3 и 4 и соответствуют ранее аннотированным профилям экспрессии сублинейных клеток человека (рис. 6b и рис. 16-17 в приложении).Кластер 1 и, в меньшей степени, кластер 7 объединили человеческие и мышиные клетки Lining Prg4 High (рис. 6b и рис. 17b в приложении). Они также содержат недооцененное ранее пролиферативное смешанное состояние выстилки/сублининга SF (см. ниже), что соответствует идее их клеточной экспансии в пораженных суставах. Наконец, кластер 5 содержит большую часть мышиных S2d (Dkk3+) SLSF, а M5 связан с клетками человека в обоих кластерах 5 и 6, что позволяет предположить, что оба этих человеческих кластера (H5 и 6), вероятно, приобретают «промежуточный» артрит-специфический профиль, который мы идентифицировали в состояниях hTNFtg SF (рис. 6b и Suppl.Рисунок 17б).

    Дополнительная фигура 12. Регуляторные элементы, обогащенные мотивом Runx1, контролируют экспрессию генов Runx1 и Cd44 во время состояния артрита.

    (а). Снимок геномного трека расширенного локуса гена Runx1 (chr16, 92 576 073–92 926 074). Экспрессия гена одной клетки (Log2 GeneIntegrationMatrix: Runx1) в субпопуляциях SF и болезненных состояниях (wt, hTNFg) показана справа. Ниже показаны объединенные пики по субпопуляциям SF (Peaks) и дифференциально доступные пики между субпопуляциями SF (All_DAR).Соответственно также сообщаются дифференциальные доступные пики со значительно повышенным сигналом scATAC-seq в клетках S2d hTNFg (S2d_DARs), S4b hTNFg (S4b_DARs) и S4a hTNFg (S4a_DARs). Предполагаемые связи между пиками и генами для внутригенных и дистальных межгенных регуляторных элементов показаны ниже (Peak2GeneLinks). Цветовая шкала показывает уровень корреляции между пиковой доступностью scATAC-seq и интегрированной экспрессией гена scRNA-seq (значение).

    (б). то же, что и для расширенной области промотора гена Cd44 (chr2, 102 851 664–102 951 665).

    Дополнительная фигура 13. Анализ обогащения мотивов в доступных областях, специфичных для кластера scATAC-seq, определяет различные типы регуляторных программ в субпопуляциях SF.

    (а). Тепловая карта, показывающая значения обогащения мотивов с поправкой на P для каждой субпопуляции SF. Анализ обогащения мотивов проводили в пределах пиков маркера SF, изображенных на фигуре 1D (нижняя панель). Цвет обозначает величину обогащения (-log10 (скорректированное значение P), гипергеометрический тест). Столбцы упорядочиваются с помощью двоичной сортировки.

    (б). Характерные графики выбранных мотивов TF с регуляторной активностью в гомеостатической, промежуточной и выстилающей субпопуляциях SF. Цвет означает баллы отклонения мотива (см. рисунок 4 и методы).

    Дополнительный рисунок 14. Цис-регуляторное моделирование (CisTopic) на scATAC-seq резюмирует идентификацию предполагаемых программ регулирования артрита.

    (а). Представление UMAP SF в двух болезненных состояниях с использованием вероятностей клеточных топиков. (Wt и hTNFtg, как указано). Клетки окрашены в соответствии с кластерными идентичностями, а пунктирная линия/отмеченная область подчеркивает динамические изменения промежуточной и выстилающей субпопуляций во время прогрессирования заболевания.

    (б). Цистопическое моделирование (см. Методы) цис-регуляторных тем с использованием скрытого распределения Дирихле. Оптимальная модель из 12 тем (стрелка) была выбрана на основе логарифмической вероятности.

    (с). UMAP Feature Графики вероятностей тем для каждой ячейки для каждой смоделированной темы в агрегированном наборе данных scATAC-seq.

    (г). Тепловые карты, показывающие z-показатели (столбцы) темы для каждой ячейки для каждой смоделированной темы (строки) для каждого болезненного состояния (левая панель: WT, правая панель: hTNFtg).

    (д).Выбор репрезентативных результатов обогащения мотивов, обнаруженных в наиболее способствующих областях темы 5, темы 8 и темы 12.

    Дополнительная фигура 15. Упорядочивание клеток по идентифицированной траектории с использованием значений латентного времени и альтернативных методологий.

    (а). Графики UMAP, отображающие результаты скорости РНК, детализирующие клеточные переходы и динамические отношения между кластерами SF в наборах данных WT и hTNFtg (неделя 4 и неделя 8, Tg4 и Tg8 соответственно).

    (б). левая сторона: UMAP plost образца hTNFtg, клетки окрашены по их потенциалу принадлежности к начальному (слева) или конечному состоянию (справа) идентифицированной траектории (верхняя панель) и UMAP образцов hTNFtg, клетки окрашены по латентному значению времени (нижняя панель).На панелях латентного времени слева расчеты проводились с учетом корневой ячейки из кластера S5, а на правой панели клетки из кластера S2.b считались корневыми. (См. Методы).

    Правая сторона: график UMAP с выделением выбранного тренда траектории по S2.b/S5, S2.a, S2d, S4.b и S4.a).

    (с). Разделы, идентифицированные алгоритмом PAGA, и минимальное остовное дерево, созданное Slingshot, предполагают аналогичную глобальную структуру данных мыши, подтверждая существование траекторной основы, которая включает кластеры S2.а, С2.г, С4.б, С4.а.

    (г). Проекции UMAP образцов WT (слева) и hTNFtg (справа), где клетки окрашены на основе оценок сигнатур для термина GO «Ответ на TNF» (верхняя панель) или нормализованной экспрессии Notch4 (нижняя панель).

    Дополнительная фигура 16. Интегративный анализ человека / мыши с использованием доступных наборов данных scRNA из SF пациентов с РА и мышей hTNFtg.

    (а). Проекции UMAP, показывающие распределение клеток в интегрированных выровненных кластерах HM для каждого из наборов данных, используемых в анализе интеграции человека и мыши, как указано.

    (б). Гистограммы, показывающие относительную численность клеток, принадлежащих каждому из интегрированных кластеров в наборах данных, описанных в (а).

    Дополнительная фигура 17. Распределение клеток SF человека и мыши, как указано ранее при интегративном анализе.

    (а). Ячейки из 4 наборов данных, используемых в интеграционном анализе, нанесены на общий интегрированный UMAP-пространство и окрашены в соответствии с их исходной аннотацией.

    (б). Гистограммы, показывающие распределение ячеек (с использованием исходной аннотации) по интегрированным кластерам для наборов данных слева.

    Рисунок 6. Интегративный анализ SF от мышиной модели hTNFtg 197 и суставов человека с РА.

    (а). Интеграция 24 042 SF пациентов с РА (3 различных исследования, Zhang et al., 2019, Wei et al., 2020 и Stephenson et al., 2018) с нашими 3051 SF hTNFtg выявила 7 человек (H)-мышь (M), выровненных Кластеры СФ. Отдельный график распределения UMAP для объединенных ячеек наборов данных человека (с пониженной выборкой до 3051 клетки) и ячеек наборов данных мыши, окрашенных в соответствии с идентичностью кластера, подчеркивает поразительное межвидовое перекрытие для гомеостатических, промежуточных и подкладочных групп.

    (б). Тепловая карта корреляции (средняя экспрессия MVG) между кластерами SF человека и мыши. Обратите внимание на очень значительное сходство в программах экспрессии H и M внутри данного кластера и внутри функциональных групп клеток.

    (с). Тепловая карта, показывающая набор обогащенных функциональных терминов и путей в кластерах H и M. Обратите внимание на совместную кластеризацию H и M в данной группе клеток и сегрегацию различных терминов GO для каждой функциональной группы.

    (г).Характерные графики репрезентативных маркерных генов, обычно экспрессируемых между гомологичными клетками H и M для гомеостатических (зеленая рамка), промежуточных (синяя рамка) и выстилающих (красная рамка) групп, а также для генов Prg4 и Thy1 (черный ящик).

    Функциональное межвидовое сходство было подтверждено с помощью анализа обогащения GO маркерных генов и совместной кластеризации групп (H) и (M) (таблицы 8 и 9 Приложения). Мы выделяем законсервированные функции и процессы SLSF в регуляции васкулогенеза, пролиферации клеток, развитии мышечной ткани, обновлении костей и тканей (кластеры h4, M3, h5 и M4) (рис. 6c).Мы демонстрируем, что кластеры M5 и H5 отмечены патогенными особенностями RA, такими как секреция металлопротеиназы, катаболические процессы коллагена и сигнальные пути разрушения кости, что еще раз подтверждает сходство с Dkk3+ SFs в модели hTNFtg . Кластеры 1, 6 и 7, которые содержат SF из выстилающего синовиального компартмента, которые ранее были признаны за их деструктивные свойства, демонстрируют пролиферативные пути, но также, по-видимому, регулируют связанные с иммунитетом пути и пути адгезии/миграции (рис. 6с).Кроме того, ключевые маркерные гены показывают хороший уровень консервативности между данными мыши и человека (рис. 6d).

    На нормативном уровне интеграция данных человека и мыши с использованием алгоритма SCENIC позволила сделать вывод об общих регуляторных сетях TF (регулонах). Вкратце, мы сначала идентифицировали коэкспрессируемые гены, чтобы сформулировать предполагаемые регуляторные связи, но сохранили только регуляторные связи с прямым родством мотивов между генами и TF. Наконец, мы оценили каждый регулон в каждой клетке, используя анализ AUC (см. Методы).Затем мы сохранили все распространенные и консервативные TF, работающие в наборах данных от пациентов с РА и мышей с артритом. Мы идентифицировали регуляторные модули мыши (кластеры TF) путем применения попарной корреляции между отклонениями мотивов консервативных TF мыши/человека и применения иерархической кластеризации, как описано ранее 56 . Этот подход идентифицировал три основных регуляторных модуля, определяющих состояния выстилающего, промежуточного и сублинейного состояния, и демонстрирует существенное совпадение между видами (рис. 7а).Регулоны регулируются активностью Ar, Dlx3 и Runx1 TF (рис. 7b), а анализ обогащения GO TF и ​​нижестоящих генов (рис. 7c) показал, что модули имеют общие функциональные возможности у обоих видов: первый модуль (Ar) контролирует мультипотентные функции основного ядра SLSF; второй модуль (Runx1) выполняет функции, отражающие скорее воспалительный профиль, соответствующий промежуточному профилю наших hTNFtg SLSF, и мы обнаружили до 25 из 107 основных генов мыши в качестве генов-мишеней в клетках человека (Suppl.Таблица 10) подчеркивает трансляционный потенциал таких генов, как Tnfaip3 и 6, Tlr2, Lrrc15 и Bmp2. Следует отметить, что модуль три (Dxl3) демонстрирует менее известные функции, которые должны быть связаны с профилем выстилающего SF человеческих и мышиных SF (рис. 7c и таблица 10 в Приложении).

    Рис. 7. Регуляторные сети общих генов (GRNS) в SF мышей hTNFtg и RA человека.

    (а). Регуляторный сетевой анализ наборов данных о мышах и людях выявил 17 общих регулонов. Корреляционный и кластерный анализ по данным hTNFtg выявил организацию регулонов в 3 основных модуля.Справа показаны репрезентативные основные мотивы TF для каждой группы.

    (б). График UMAP, изображающий клетки с активностью регулонов AR, RUNX1 и DLX3 для данных человека.

    (с). Сводная таблица анализа обогащения ГО модулей, показанных на (а). Для каждого модуля мы указываем TF (отображаемые во втором столбце) и обычно обогащаемые GO и регулоны мыши и человека, соответствующие p-значения (с третьего по пятый столбцы).

    В заключение, наш интегративный подход устанавливает общие подмножества SF мыши и человека с очень похожими хроматиновыми и транскрипционными программами и функциональными характеристиками, подтверждая прогностическую способность модели hTNFtg для более глубокого понимания механизмов и эффективных доклинических исследований и разработок для открытия новых SF-таргетная терапия.

    Обсуждение

    В этом исследовании мы предположили, что определение различий между нормальным и патогенным состоянием фибробластов на мышиной модели полиартрита hTNFtg поможет нам раскрыть и разделить различные профили фибробластов и основные регуляторные сети, которые специфически характеризуют TNF. -опосредованная артритная патология.

    Нормальная синовиальная оболочка

    Мы впервые сообщаем, что нормальная синовиальная оболочка демонстрирует различные состояния SF, что отражает сложность ткани SF, выполняющей различные функции для поддержания гомеостаза.Из-за своего мезенхимального происхождения нормальные состояния SF разделяются по их ответам на факторы роста и сигналы дифференцировки, такие как WNT, BMP, TGFb. В соответствии с разнообразием вызванных ответов и разнообразием наблюдаемых состояний, наш анализ GO был важен для полной оценки связанных функций кластеров SLSF (Thy1+) в отношении контроля ангиогенеза (кластер S3), остеогенных процессов (кластеры S2), хондрогенеза и мышечной ткани. разработка (кластер S1). Сходным образом, Thy1-LSFs имеют менее выраженный профиль, регулируя размер выстилающего слоя за счет апоптотических и миграционных свойств.Благодаря своему специфическому секретому (предсказываемому здесь по транскриптомной сигнатуре), выстилающие SF непосредственно реагируют на ранение, тогда как механизмы регуляции митохондриальных уровней кальция, возможно, способствуют правильному сигнальному бдительности. Детальное механистическое понимание сегрегации функций в гомеостатической синовиальной оболочке должно помочь разработать стратегии, помогающие сохранить ее полезные свойства, которые кажутся нарушенными во время патогенеза.

    Вывод о происхождении SF в гомеостатических условиях указывает на три основных полюса инициации SF с клетками из кластеров S1 и S2b, сохраняющими характер SLSF, но движущимися в основном к состояниям S3 и S2a/S5 соответственно, и «автономной» активностью S4a, представляющей стволовую клетку как родоначальный признак для здоровой выстилки SF (Suppl.Рисунок 17). Анализ регуляторных сетей, стоящих за транскрипционными состояниями SF, выявил гомеостатические TF, управляющие здоровой синовиальной оболочкой, что подтверждает предсказание идентичности здоровых SF. Мы идентифицировали членов семейства Dlx (Dlx3 и 4) и Lhx (Lhx2 и 9), которые стабильно экспрессируются в здоровых Prg4 high LSF. Хотя эти факторы еще не были изучены в биологии SF, известно, что они облегчают важнейшие функции в коже, в формировании и развитии скелета, а также в морфогенезе зубов 57–59 , что указывает на то, что они могут играть уравновешивающую роль в регенерации. суставных структур.LSF также характеризуются экспрессией Tgif1 , который, как сообщалось, действует как промотор или репрессор рака, в зависимости от контекста. Это репрессор ретиноидов 60 и передачи сигналов TGFb, который также задействует активность гистоновых деацетилаз 61,62 , регулируя хондрогенез 63 и воспалительный фенотип эндотелиальных клеток 64 , предполагая аналогичную роль в гомеостатическом фенотипе ЛСФ . По той же линии доказательств члены семейства GATA регулируют S2b SF (GATA-4 и GATA-6), хорошо связаны с мезенхимальными ответами на механический стресс в ткани сердца 65 .Однако их роль в гомеостазе суставов до сих пор плохо определена. Интересно, что GATA6 усиливает экспрессию маркеров гладких мышц, таких как α-SMA, SM22-α, при обработке TGFb мезенхимальных стволовых клеток , 66, , что указывает на то, что он также может влиять на сходные ответы и состояние активации GATA6-экспрессирующих SLSF. S1 SF маркируются Col15a1, управляются Tcf15, фактором транскрипции, который маркирует примитивную идентичность гемопоэтических стволовых клеток, тем самым подтверждая их роль в качестве предкового состояния SF 44,67 .

    Пораженная синовиальная оболочка при TNF-опосредованном артрите

    В нашем сравнительном анализе мы определили характер изменений в артритной строме, продемонстрировав относительное ремоделирование молекулярных профилей как сублинейного, так и выстилающего SF. В свете структурных свойств и гомеостатических функций кластеров SF, выявленных в здоровой синовиальной оболочке, мы обнаружили дифференциальное расширение профиля воспалительной выстилки за счет сигнатуры SF здоровой выстилки (Приложение, рисунок 7).Точно так же мы заметили относительное снижение гомеостатических профилей сублимации SF (S1, S2a, c, S3, S5 и S4a, рис. 2), что, возможно, отражает отклонения в их функциональности во время болезни, что, таким образом, убедительно подтверждает ранее сообщавшиеся отклонения в репаративных функциях 68 ,69 в тканях РА. В соответствии с сообщениями о расширении сублинейного компартмента SF в RA 18,19 , мы идентифицировали две возникающие, специфичные для артрита промежуточные субпопуляции Thy1+ SF (S2d и S4b).Клетки S2d определяются экспрессией Dkk3 и Lrrc15, двух маркеров, которые были индивидуально описаны и недавно связаны с возникшими патологическими состояниями фибробластов при RA 19 и других воспалительных и раковых состояниях человека 44,70 соответственно. Ремоделирование тканей и воспаление входят в число функций, характеризующих расширенный сублинейный тип S2d (Dkk3/Lrrc15+) SF. Другие расширенные S4b SF также экспрессируют Dkk3, однако их состояние в основном характеризуется высокой пролиферативной способностью и способностью к импринтингу ДНК, что свидетельствует о структурных и эпигенетических изменениях, описанных для RA 71-73.Примечательно, что Thy1+ S4b SF имеют общий паттерн высокой экспрессии Prg4 наряду с другими особенностями выстилки Thy1-SF. Поскольку эти два состояния фибробластов отсутствуют в здоровых условиях, их увеличение может свидетельствовать о TNF-опосредованном паттерне дифференцировки SF при артрите. Эта гипотеза подтверждается выводом о происхождении, основанным на scVelo, показывающим основной признак дифференцировки в синовиальной оболочке мышей: сублинейные S2b SF представляют собой состояние корневых фибробластов, из которого возникают две субпопуляции SF, специфичные для артрита.Программа дифференциации, как правило, нацелена на состояние Prg4 high SF и предполагает судьбу SLSF (Thy1+) как континуум по отношению к LSF (Thy1-) при заболевании. Этот транскрипционный сигнал соответствует обнаруженному расширению профиля воспалительной выстилки (S4a-Suppl. Figure 7) и указывает на состояния S2d и S4b как на промежуточную стадию в прогрессирующем расширении и дифференцировке артритических SF.

    Общие регуляторные сети, управляющие больной синовиальной оболочкой мыши и человека

    Мы оценили трансляционное влияние этих результатов, сравнив наши данные по мышам с доступными данными scRNAseq, полученными от пациентов с РА.Мы выявили высокую степень сходства по кластерам и функциям. Интересно, что SF DKK3/LRRC15+ действительно демонстрировали высокое сходство экспрессии между видами, и в соответствии с предыдущими наблюдениями они приобретают промежуточную характеристику, лежащую между сублинейными/периваскулярными Notch4+ и SF Prg4 high в синовиальной оболочке артрита как человека, так и мыши (Suppl. Рисунок 18 создан с использованием данных, описанных в ссылке 20 ). Независимо от того, зависит ли эта общая черта между ревматоидным артритом человека и обеими мышиными моделями артрита (хронический- hTNFtg и острый артрит, индуцированный переносом сыворотки-STIA), от исходящих артритогенных сигналов TNF прямо или косвенно через вторичную индукцию передачи сигналов Notch, как сообщалось ранее 74 , еще предстоит изучить in vivo.Важно отметить, что необходимость понимания того, как это промежуточное состояние SF влияет на патогенность и приводит к деструктивной природе артрита посредством активации и экспансии LSF, означает необходимость будущих целевых исследований картирования функций и клеточных судеб.

    Дополнительная фигура 18. Экспрессия Dkk3 и Lrrc15 в промежуточном транскрипционном состоянии SF при артрите у мышей и человека

    (a). Характерные графики синовиальных фибробластов мыши из Wei et al., 2020. Клетки окрашены нормализованной экспрессией генов Thy1, Prg4, Lrrc15 и Dkk3.

    (б). Проекция UMAP (слева) синовиальных фибробластов мыши показана на (а). Ячейки окрашены в соответствии с оценкой подписи. Показатель сигнатуры рассчитывается как сумма масштабированных нормализованных значений экспрессии для 71 промежуточного гена, описанного в Wei et al., 2020. График плотности (справа) тех же показателей сигнатур для синовиальных фибробластов РА человека из Zhang et al., 2019.

    GRN, обнаруженные как в наборах данных мыши, так и человека, и идентификация открытых областей хроматина (scATAC) вокруг генов-мишеней при артрите позволяют нам разъединить модуляторы патогенной экспансии SLSF в LSF и идентифицировать уникальные паттерны активности.Хорошо известно, что среди этих очень значимых факторов компоненты пути NF-κB NF-κB1/2, RelA и RelB в значительной степени регулируют воспалительные процессы, включая воспалительные артриты 75,76 . Интересно, что ранее мы рассматривали SF-специфические опосредованные NF-κB ответы при развитии артрита у мышей hTNFtg и механически показали, что основной активатор NF-κB, киназа IKK2, действует как двойной модулятор артрита, хотя оба воспалительные и смертельные реакции SFs 6 .Регулятор окислительного стресса Nfe2l2/NRF2 сильно экспрессируется во время болезни вместе с такими факторами, как Bach2, Fosl1 и Mef2d, которые, как было показано, контролируют активность NRF2 77–79 , что указывает на наличие молекулярной сети, связанной с обширным окислительным стрессом RA 80 , и выделение конкретных компонентов пути с терапевтическим потенциалом при TNF-опосредованном артрите. Интересно, что путь Nrf2/Keap1 может инактивировать активность NF-κB посредством убиквитин-опосредованной деградации IKK2 81 , что указывает на связь между нерегулируемыми путями NF-κB и NRF2 при артрите.Помимо гемопоэза, Runx1 был связан с остеохондральной дифференцировкой (наряду с Runx2 и 3), активацией миофибробластов 47 и был предложен в качестве двойного модулятора воспаления и даже эпигенетического модификатора, в зависимости от контекста 82–88 . Благодаря своей надежной повышенной экспрессии Runx1 стал важным главным регулятором SF DKK3/LRRC15+ у обоих видов, что указывает на многообещающий основной путь заболевания, который требует дальнейших исследований.Наконец, интегративный анализ показал, что hTNFtg SF имеют много общего с RASF человека как на транскрипционном, так и на эпигеномном уровнях, что свидетельствует о дополнительной прогностической ценности модели hTNFtg для интегративных трансляционных исследований функций SF.

    Материалы и методы

    Мыши/соблюдение этических норм

    Все мыши были выращены и содержались на генетическом фоне C57BL/6J в вивариях BSRC Alexander Fleming в особых условиях отсутствия патогенов в соответствии с руководством IACUC BSRC «Александр Флеминг» и совместно с Управлением ветеринарной службы Префектуры Греческой Республики Аттика/Греция.Эксперименты контролировались и проверялись на протяжении всего времени соответствующим органом по защите животных на предмет соответствия выданному разрешению.

    Проточная цитометрия и флуоресцентно-активированный сортинг клеток

    Выделение SF проводили из обеих задних лап. Голеностопные суставы вырезали у 3 мышей WT в возрасте 4 недель и 6 мышей hTNFtg , 3 в возрасте 4 недель и 3 в возрасте 8 недель. Ткани дезагрегировали путем инкубации в течение 30 мин при 37°С в среде ферментативного расщепления, состоящей из DMEM, 10% термоинактивированной FBS, коллагеназы (0.5 мг мл -1 ) из Clostridium histolyticum (Sigma, C5138) и 0,03 мг мл -1 ДНКазы (Sigma, 9003-98-9). После промывания клеток PBS, содержащим ДНКазу, их блокировали в 1% BSA в PBS и Fc-блокаторе (немеченый анти-CD16/32, Biolegend 101302) в течение 10 мин при 4°С и окрашивали конъюгированными с флуорофором антителами в течение 20 мин при 4°С. °C (анти-Pdpn PE-Cy7, Biolegend 127411; анти-Thy1 A647, Biolegend 105318; анти-CD31 APC/Fire 750, Biolegend 102433; анти-CD45 APC-Cy7, Biolegend 103116; анти-Ter119 APC-A780, eBioscience. 47-5921-80).После промывки PBS клетки ресуспендировали в буфере FACS (PBS, 1% BSA). Сортировку клеток проводили с помощью BD FACSAria III и программного обеспечения BD FACSDiva, а мертвые клетки исключали с помощью окрашивания Dapi. Походка при сортировке для одноклеточной РНКсек и групповой РНКсек была разной (см. рис. 1В). Для отсортированных популяций чистоту и жизнеспособность определяли путем повторного анализа целевой популяции на основе маркеров клеточной поверхности сразу после сортировки. Чистота составляла >99% для каждой целевой популяции.

    Гистопатология и иммунофлуоресценция

    Гистологическое окрашивание гематоксилин-эозином проводили на парафиновых срезах голеностопного сустава, как описано ранее 7 .Для иммунофлуоресценции криосрезы исследовали с помощью антител против Thy1 (Alexa Fluor 488 против мышиного CD90.2, Biolegend 105315 или Alexa Fluor 647 против мышиного CD90.2, Biolegend 105318, оба клона, 30-h22), Clu ( Поликлональные кроличьи античеловеческие CLU/кластерины, LS-C331486, LSBio), Gdf10 (поликлональные антитела GDF10, BS-5720R, антитела Bioss), CD31 (крысиные антитела APC против мышиных CD31, 551262, BD Biosciences, клон MEC 13.3), Notch4 (антитела против -Notch4 антитело, ab23426, abcam), Comp (антитело против COMP/хрящевого олигомерного матричного белка, ab231977, abcam), CD44 (FITC Rat Anti-mouse CD44, 553133, BD Biosciences, клон IM7) и Prg4/лубрицин (анти -лубрицин/антитело MSF, ab28484, abcam).Alexa-Fluor 647-конъюгированные вторичные антитела (антикроличьи, A21244, 1834794; антикрысиные, A21247, 1719171; антимышиные, A21235, 1868116; и антихомячковые, A21451, 1572558, Invitrogen), биотинилированные вторичные антитела (анти -крыса, БА-9400, и антикролик, БА-1000). Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа TCS SP8X White Light Laser (Leica) и микроскопа Eclipse E800 (Nikon), оснащенного камерой Dxm1200F (Nikon). Анализ изображений и количественные оценки были выполнены с помощью программного обеспечения ImageJ/Fiji (NIH).

    Генерация данных секвенирования одноклеточной РНК на основе капель

    Отсортированные живые Pdpn + CD45 CD31 Ter119 синовиальные клетки задних лап мышей WT в возрасте недель и нед. мышей на 2 разных стадиях заболевания, в раннем возрасте 4 недель и в возрасте 8 недель, мышей подвергали воздействию 10-кратного раствора Chromium Single Cell 3′ Solution v3. Платформа была использована для создания целевых 3000 одноклеточных гелевых шариков-эмульсий на образец, загруженных с исходной жизнеспособностью клеток 80%.Библиотеки scRNA-seq были подготовлены в соответствии с руководством пользователя 10X Genomics (наборы реагентов Single Cell 3’ v3). После инкапсуляции эмульсии переносили в термоциклер для комнатной температуры. кДНК очищали и амплифицировали с праймерами, входящими в состав реагентов Single Cell 3’ (10X Genomics). После очистки с помощью гранул 0,6X SPRIselect (Beckman Coulter) качество и выход кДНК оценивали с использованием Agilent Bionalyzer 2100. Используя предоставленную смесь для фрагментации ферментов, библиотеки фрагментировали, репарировали концы и А-хвосты.Продукты очищали с помощью шариков SPRIselect, а адаптеры, входящие в комплект, лигировали. После очистки продуктов лигирования библиотеки амплифицировали и индексировали с помощью уникального индекса образца i7 посредством ПЦР-амплификации. Окончательные библиотеки были очищены с двух сторон, и их качество и размер были оценены с использованием Agilent Bioanalyzer 2100. Библиотеки были секвенированы путем объединения их в 1 дорожку на секвенаторе Illumina NextSeq 500 до глубины 100 миллионов прочтений каждая (одна дорожка 75PE). Прямое чтение включало 28 п.н. для 10X Barcode-UMI, затем 8 п.н. индекса i7 (образцовый индекс) и 10 п.н. при обратном чтении.Чтения были преобразованы в формат .fastq с использованием mKfast из Cellranger v3 (10X genomics). Затем считывания выравнивали с эталонным геномом мыши (mm10, аннотация Ensembl, выпуск 91). Этапы выравнивания считывания, подсчета UMI и агрегирования отдельных матриц подсчета образцов в объединенную единую матрицу выполнялись с использованием конвейера 10x Genomics Cell Ranger (v3).

    Компьютерный анализ данных секвенирования одноклеточной РНК

    Пакеты DoubletFinder 89 и Seurat R 90,91 использовались для обнаружения дублетов и контроля качества клеток.Клетки, содержащие менее 500 генов или более 10% прочтений, картированных в митохондриальный геном, исключали из дальнейшего анализа. Последующий анализ данных был выполнен с использованием функций пакета Seurat, как описано ниже. Нормализация данных выполнялась с помощью функции NormalizeData с использованием «LogNormalise» в качестве метода нормализации и 10000 в качестве коэффициента масштабирования. Для выявления наиболее изменчивых генов была применена функция FindVariableFeatures со значением mean.var.plot (mvp) в качестве метода отбора, а остальные параметры были установлены по умолчанию.Масштабирование значений экспрессии генов было достигнуто с помощью функции scaleData. Анализ основных компонентов масштабированных значений наиболее высокоизменчивых генов, как было определено на предыдущих этапах, выполнялся с помощью функции runPCA. Чтобы найти оптимальное количество основных компонентов, которые будут использоваться на этапе кластеризации и нелинейного уменьшения размерности, была проведена кросс-валидация SVD k-fold с библиотекой dismo R (https://cran.r-project.org/web). /packages/dismo/index.html). Для кластеризации ячеек применялся подход кластеризации на основе графа, включающий построение графа k ближайших соседей ячеек и использование алгоритма обнаружения сообщества Лувена.Для этого использовались функции FindNeighbors и FindClusters, первая с параметром dims, установленным в диапазоне 1:25, а вторая с параметром разрешения, установленным на 0,6. Методы нелинейного уменьшения размерности tSNE и UMAP использовались для визуализации клеток в 2D с помощью функций runTSNE и runUmap с использованием оптимального количества ПК = 25. Для идентификации кластерных маркерных генов был проведен анализ дифференциальной экспрессии (критерий суммы рангов Уилкоксона, скорректированное значение p на основе поправки Бонферрони с использованием всех признаков в наборе данных, группа 1 = клетки, принадлежащие тестируемому кластеру, группа 2 = остальные клетки) с функцией FindAllMarkers, исключающей гены, экспрессия которых составляет менее 25% в обеих группах клеток или абсолютное значение среднего логарифмического изменения менее 0.25. Такой же подход применялся как при анализе объединенных, так и отдельных образцов (в этом анализе использовались только клетки, принадлежащие анализируемому образцу). Анализ чрезмерной репрезентативности набора генов был проведен с использованием пакета R clusterProfiler 92 . Списки генов с повышающей регуляцией из каждого кластера (pval <0,01 и avgLFC >= 0,25), определенные на предыдущем этапе, использовались в качестве входного списка генов. Все активные гены набора данных рассматривались как фоновый набор генов.Были использованы наборы генов «биологических процессов», полученные из базы данных GO. Обогащенными терминами GO считались те, у которых скорректированное значение p < 0,05 и количество генов >= 3.

    Анализ траекторий

    Анализ скорости был проведен с использованием velocyto v.0.17 93 и scVelo v.0.2.3 54 . В частности, для подсчета сплайсированных и несплайсированных прочтений для каждого образца в отфильтрованных файлах BAM, сгенерированных cellranger, был запущен конвейер 10x velocyto, а для вывода скорости одноклеточной РНК применялась динамическая модель scVelo.Для предсказания корневого и терминального состояний базового марковского процесса применялись соответствующие функции scVelo. Полученные корневые клетки использовали для определения порядка латентного времени клеток hTNFtg .

    По результатам анализа скорости РНК использовали пакет R Slingshot 94 и пакет Python PAGA 95 . Во время запуска Slingshot для ячеек использовались координаты UMAP, а кластеры S2b и S5 устанавливались в качестве возможных отправных точек.Полученное минимальное остовное дерево подтверждает существование патогенной ветви, состоящей из S2a, S2d, S4b и S4a.

    Генетическая регуляторная сеть scRNA-seq человека (GRN) вывод

    Чтобы вывести GRN из интегрированных данных scRNA-seq человека, рабочий процесс SCENIC 96 был применен к нормализованной матрице экспрессии. Вкратце, первоначально коэкспрессированные гены были сгруппированы с использованием инструмента arboreto python 97,98 . Затем, используя CisTarget 99 , все предполагаемые группы, которые включали фактор транскрипции (TF), считались GRN, в то время как все гены с мотивом, свидетельствующим о соответствующем TF в их регуляторном пространстве (hg38 refseq-r80 500bp_up_and_100bp_down_tss.mc9nr, hg38 refseq r80 10kb_up_and_down_tss.mc9nr.feather) считались действительными целями перехода. Наконец, каждый образованный регулон оценивали в каждой клетке, используя AUCell 96 .

    Интеграция данных о людях

    Для интеграции данных о людях использовались 3 разных набора данных 16,17,19 . На первом этапе анализа гены человека были преобразованы в гомологи мыши с использованием базы данных Ensembl Biomart и MGI, в результате чего был получен окончательный набор из 17 594 гомологичных пар.Что касается используемых клеток, то из набора данных мыши были обработаны только клетки, происходящие из объединенных образцов hTNFtg (3051 клетка), а из трех наборов данных человека были обработаны только клетки, полученные от пациентов с РА (24042 клетки). После этого стратегия интеграции, описанная в 91 , была реализована через пакет Seurat. В частности, все четыре набора данных были обработаны для нормализации и обнаружения большинства изменчивых генов с использованием функции normalizeData с настройками по умолчанию и FindVariableFeatures (метод установлен на vst, а количество переменных признаков равно 2000).Привязки между всеми наборами данных были определены с помощью функции FindIntegrationAnchors с параметром измерений, установленным на 30, а затем эти привязки были использованы для объединения четырех наборов данных вместе с помощью функции IntegrateData. Конечный объект, содержащий все клетки, обрабатывали стандартным образом, выполняя этапы уменьшения размерности, кластеризации и анализа дифференциальной экспрессии. Интегрированные кластеры были определены после использования функции FindClusters с разрешением 0,3.Наконец, анализ дифференциальной экспрессии был выполнен с использованием функции findAllMarkers со следующими пороговыми значениями: pval <0,01 и avgLFC >= 0,25. Что касается анализа функционального обогащения, в качестве входных данных для Metascape 100 использовались наборы данных человека и мыши с повышенной регуляцией, значимые термины и пути (pval <0,05) использовались для оценки сходства и различий между наборами данных. (Для всех сравнений между человеком и мышью, описанных выше, окончательный интегрированный объект был разделен на два, один из которых содержал все клетки человека из трех разных наборов данных, а другой содержал все клетки мыши из объединенных образцов hTNFtg .)

    Выделение РНК и объемное секвенирование 3′-РНК

    РНК выделяли из отсортированных синовиальных фибробластов голеностопных суставов (сублинейных и выстилающих) здоровых (4-недельного возраста) и hTNFtg мышей (4- и 8-недельного возраста) с использованием мини- или микронабор RNeasy (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя. Количество и качество образцов РНК анализировали с помощью набора Agilent RNA 6000 Nano с биоанализатором Agilent. Образцы РНК с числом целостности РНК (RIN)> 7 использовали для создания библиотеки с использованием протокола подготовки библиотеки 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit Protocol for Ion Torrent (QuantSeq-LEXOGEN™) в соответствии с инструкциями производителя.Набор DNA High Sensitivity Kit в биоанализаторе использовали для оценки количества и качества библиотек в соответствии с инструкциями производителя (Agilent). Затем библиотеки объединяли и формировали шаблоны с использованием набора Ion PI™ IC 200 (ThermoFisher Scientific) на приборе Ion Proton Chef или системе Ion One Touch. Секвенирование проводили с использованием набора Ion PI™ Sequencing 200 V3 Kit и чипов Ion Proton PI™ V2 (ThermoFisher Scientific) на системе Ion ProtonTM в соответствии с инструкциями производителя.

    Компьютерный анализ объемных данных секвенирования РНК

    Качество файлов FASTQ оценивали с помощью программного обеспечения fastqc (Andrews, S. (2010). FastQC: инструмент контроля качества для высокопроизводительных данных о последовательностях [онлайн]. Доступно онлайн по адресу: http ://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Выравнивание прочтений с геномом mm10 проводили с помощью выравнивателя Hisat2. FeatureCounts 101 использовали для этапа суммирования прочтений на генном уровне. Анализ дифференциальной экспрессии проводили с помощью DESeq2 102 .Для каждого контраста определение дифференциально экспрессируемых генов основывалось на следующих порогах |Log2FC| > 0,58 и значение P < 0,05.

    Одноклеточный ATAC-seq (10x Genomics)

    Анализ одиночных клеток на доступный для транспозазы хроматин с использованием протокола секвенирования (scATAC-seq) проводили в соответствии с инструкциями 10x Genomics. Вкратце, после сортировки синовиальных фибробластов (подробности см. в протоколе scRNA-seq) и выделения ядер ядра ресуспендировали в 1x Diluted Nuclei Buffer (10x Genomics).В каждую реакцию транспозиции добавляли около 4600 ядер с целью целевого извлечения 3000 ядер. Транспозицию проводили при 37℃ в течение 60 минут. Создание гелевых шариков в EMulsions (GEM) с использованием Chromium Controller (10x Genomics) сопровождалось инкубацией и очисткой GEM на основе рекомендаций 10x Genomics. Амплификацию библиотек проводили в термоциклере Veriti (Thermo Fisher), запрограммированном на 98 ℃ в течение 45 с, с последующими 12 циклами (98 ℃ на 15 с, 67 ℃ на 30 с, 72 ℃ на 20 с), 72 ℃ на 1 мин и держать при 4 ℃.В свою очередь, библиотеки отбирали по двустороннему размеру с использованием реагента SPRI select (Beckman Coulter) в соответствии с рекомендациями 10x Genomics. Перед мультиплексированием библиотеки анализировали на биоанализаторе High Sensitivity DNA ChIP (Agilent) для проверки качества и определения размера фрагментов. Количественную оценку библиотек проводили с использованием набора Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher, № по каталогу Q32851). Секвенирование следующего поколения было выполнено в EMBL-Genecore (Гейдельберг) с использованием платформы NextSeq 500 для чтения парных концов 75 п.н.

    Вычислительный анализ scATAC-seq

    Анализ наборов данных scATAC-seq был проведен с использованием пакета ArchR 55 . Таким образом, эпигенетические карты ядер сортированных СФ были получены для 6679 одиночных ядер. Латентное семантическое индексирование (LSI) 53,103 , кластеризация Лувена и уменьшение размерности UMAP применялись, как описано выше (см. «Вычислительный анализ данных секвенирования РНК одной клетки»). Чтобы присвоить идентичность кластера scATAC-seq, показатели генной активности и экспрессии гена scRNA-seq были напрямую сопоставлены между двумя модальностями 91 , сначала применяя неограниченную интеграцию для получения предварительных знаний об идентичности кластера, которые, в свою очередь, использовались в качестве ориентира. для более точного интегрирования с ограничениями 55 .Эта процедура сгруппировала клетки в 5 основных кластеров, соответствующих ранее аннотированным типам клеток, описанным выше (синовиальные фибробласты, остеобласты, хондроциты, миобласты/миоциты и сосудистые клетки, рисунок 3 в приложении). Все нефибробластные клетки были исключены из остальной части анализа, в результате чего таким же образом было повторно проанализировано в общей сложности 6046 клеток SF. Процесс интеграции между SF scATAC-seq и scRNA-seq пометил клетки scATAC-seq в соответствии с 9 субпопуляциями SF (см. выше), которые были визуализированы в пространстве UMAP (рис.Рисунок 3). Чтобы идентифицировать надежный объединенный набор пиков вдоль субпопуляций SF, MACS2 104 применяли в двух отдельных псевдообъемных повторах 55 . Затем было применено итеративное слияние пиков с перекрытием 105 на уровне псевдомассовых повторов (на субпопуляцию), а затем на уровне субпопуляций SF по всему набору данных, чтобы сформировать единый объединенный набор пиков из 158 713 областей с фиксированная длина 500 п.н. В свою очередь, пики были аннотированы в соответствии с их соответствующим положением в геноме (промотор, интрон, экзон, дистальный).Используя унифицированный набор пиков, был проведен дифференциальный анализ доступности между ячейками для определения пиков маркеров, специфичных для кластера и состояния (| Log2FC |> 0,58 и значение P <0,01). Маркерные пики были дополнительно проанализированы с использованием анализа обогащения мотивов (база данных CIS-BP) для получения маркерных мотивов, специфичных для кластера и образца (|Log2FC| > 0,58 и значение P <0,05). Для дальнейшего получения обогащенных мотивов при разрешении отдельных клеток был проведен анализ chromVar 106 .Следовательно, чтобы идентифицировать «положительные регуляторы TF» в субпопуляциях SF, доступность мотива TF коррелировала с интегрированной экспрессией гена TF в клетках, сохраняя все TF с Pearson r 2 > 0,5 и P Adjusted value < 0,05, в результате чего было получено 30 положительных регуляторов. Наконец, чтобы идентифицировать лежащие в основе GRN, связывание пика с геном вызывали с использованием корреляционного анализа между доступностью пика энхансера и интегрированной экспрессией гена (см. функцию addPeak2GeneLinks() пакета ArchRR R 55 .Все связи между генами и доступными областями с аннотированным мотивом ТФ были отмечены как предполагаемые регуляторные связи между соответствующим ТФ и геном. Впоследствии все предполагаемые регуляторные связи были отфильтрованы, чтобы сохранить только гены с повышенной экспрессией в образцах hTNFtg , а также пики с повышенной доступностью в образцах заболеваний.

    Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при рефрактерном артериите Такаясу | Ревматология

    Сэр, артериит Такаясу — редкий васкулит крупных сосудов с вариабельным естественным течением.Проявления варьируют от бессимптомного заболевания до катастрофических неврологических нарушений, а 5-летняя выживаемость составляет 60–70% у 25% пациентов с прогрессирующим заболеванием. Пятьдесят процентов пациентов реагируют на стероиды, а 30–50 % пациентов, не ответивших на лечение, получают пользу от других форм иммуносупрессии [1].

    Во всем мире было зарегистрировано одиннадцать случаев васкулита мелких или средних сосудов, подвергшихся аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) [2, 3] и еще два случая в Бразилии [4, 5].Исход варьирует: 1/1 полная ремиссия (ПР) при узелковом полиартериите, 1/3 ПР при гранулематозе Вегенера, 1/3 ПР и 1/3 частичная ремиссия (ЧР) при болезни Бехчета, 2/3 ПР при криоглобулинемии и 1/3 ПР при гранулематозе Вегенера. 1 PR при недифференцированном васкулите. Насколько нам известно, это первый случай ТГСК по поводу артериита крупных сосудов, описанный в литературе; он был кратко представлен на международной встрече [6].

    Артериит Такаясу был диагностирован в июне 1990 г. у 41-летней бразильянки с хромотой в верхних и нижних конечностях, головокружением, головной болью, полиартритом, недомоганием, миалгией и периодической лихорадкой.Поражения почек и сердца не было. Ультразвуковая допплерография (УЗИ) показала двухфазные или монофазные пульсовые волны с медленной скоростью в брюшной аорте (41 см/с), а также в верхних и нижних конечностях. Артериография показала неравномерность и стеноз брюшной аорты, обеих сонных и подвздошных артерий и левой подключичной артерии. Пациент получал лечение различными иммунодепрессантами, такими как стероиды (два импульса 6-метилпреднизолона 1 г × 3 и до 80 мг преднизолона в день с момента постановки диагноза), пероральный циклофосфамид (50 мг/день в течение 30 дней), микофенолата мофетил. (MMF; 2 г/день в течение 11 месяцев), метотрексат (25 мг/неделю в течение 6 месяцев) и хлорамбуцил (6 мг/день в течение 3 месяцев), но ни один из этих препаратов не остановил прогрессирование заболевания.В октябре 2002 г., при приеме ММФ и стероидов, магнитно-резонансная ангиограмма (МРА) показала сужение и неравномерность как сонных, подключичных артерий, так и брахиоцефальной артерии (рис. 1А). Этот результат был связан с ухудшением клинической симптоматики и побудил пациентку и ее лечащего врача выбрать наш экспериментальный протокол аутологичной ТГСК при рефрактерных аутоиммунных заболеваниях [4, 5], который был одобрен Комитетом по этике в исследованиях университетской больницы Школы. медицины Рибейран-Прету.Подписано информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией. В декабре 2002 г. также была диагностирована фибромиалгия.

    Рис. 1.

    Изображения магнитно-резонансной ангиографии до (А) и через 60 дней после (В) трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, демонстрирующие коррекцию стеноза брахиоцефальной артерии (стрелка 1) и уменьшение аномалий левой сонной артерии ( стрелка 2) и левой подключичной артерии (стрелка 3).

    Рис.1.

    Изображения магнитно-резонансной ангиографии до (А) и через 60 дней после (В) трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, демонстрирующие коррекцию стеноза брахиоцефальной артерии (стрелка 1) и уменьшение аномалий левой сонной артерии (стрелка 2) и левой подключичной артерии (стрелка 3).

    В марте 2003 года гемопоэтические стволовые клетки были мобилизованы из костного мозга с помощью циклофосфамида (2  г/м 2 ) и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) (10  мкг/кг/день), собранных с помощью лейкафереза ​​(две сеансы) и замороженные в жидкости N 2 .В апреле 2003 г. пациент был обработан циклофосфамидом (50 мг/кг/день × 4) плюс кроличий антитимоцитарный глобулин (ATG; Tecelac, Biotest, Германия; 4,5 мг/кг, разделенный на пять приемов, с предшествующим введением 125 мг гидрокортизона) с последующей инфузией стволовых клеток (3,9 × 10 6 клеток CD34+/кг). Осложнения во время нейтропенической фазы включали лихорадку неизвестного происхождения, гипергликемию, субконъюнктивальную гематому и эмоциональную нестабильность. Цефепим и тейкопланин использовались в качестве эмпирического лечения нейтропенической лихорадки, ацикловир для профилактики герпетической инфекции и триметоприм/сульфаметоксазол для профилактики инфекции Pneumocystis carinii .Г-КСФ (5  мкг/кг/день) использовали с 5-го дня до приживления нейтрофилов, которое наблюдалось на 9-й день. На 14-й день у пациентки появилась кожная сыпь, а на 16-й день она была выписана из стационара. Аменорея развивалась в дотрансплантационном периоде после применения лейпролида и сохранялась после трансплантации. Клиническое состояние быстро улучшилось; наблюдалось полное исчезновение головной боли, головокружения и недомогания, в то время как хромота конечностей значительно уменьшилась. После трансплантации (320-й день) артериальный пульс левых нижних конечностей и сонных артерий показал нормальную форму и скорость по данным допплерографии, а скорость волны брюшной аорты увеличилась до 73 см/с.В артериях верхних конечностей сохранялись участки стеноза и малоскоростная двухфазность скорости волны правой нижней конечности. При последнем диспансерном наблюдении на 270-е сутки у больного были проявления только фибромиалгии и парестезии кистей. С-реактивный белок был 2,4 мг/дл до трансплантации и 0,8 мг/дл на 147-й и 183-й день. Скорость оседания эритроцитов составляла 84 мм/1 ч (метод Вестергрена) до трансплантации и 34 мм/1 ч в день. 350. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови показало инверсию соотношения CD4/CD8 и снижение числа клеток памяти CD4 на 210-й день после трансплантации.Уровни иммуноглобулина до и после трансплантации были соответственно: IgG 750 и 924 мг/дл, IgA 395 и 110, IgM 426 и 144. При оценке на 60-й день МРА ветвей дуги аорты показало восстановление предшествующего стеноза брахиоцефальной артерии. и значительное улучшение аномалий левой сонной артерии и левой подключичной артерии (рис. 1В). На 400-й день пациент прекратил какую-либо иммуносупрессию.

    Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток применяется с 1996 г. для лечения изолированных рефрактерных аутоиммунных заболеваний; более 500 аутологичных трансплантаций зарегистрировано в базе данных EBMT/EULAR в Базеле [7] и около 150 выполнено в Северной и Южной Америке [8, 9].В настоящее время основными показаниями для ТГСК являются неврологические заболевания, такие как рассеянный склероз, и ревматические заболевания, такие как системная красная волчанка, системный склероз, а также взрослый и ювенильный ревматоидный артрит. Многие другие аутоиммунные заболевания, в том числе артериит мелких и средних сосудов [2, 3], успешно лечатся с помощью аутологичной ТГСК, но это первый случай артериита крупных сосудов, подвергшийся такому лечению.

    Механизмы терапевтического эффекта ТГСК при аутоиммунных заболеваниях в настоящее время изучаются и могут включать иммуносупрессию, вызванную высокодозной химиотерапией и иммунотерапией, толерантность, вызванную аутологичными стволовыми клетками, или восстановление тканей, опосредованное трансдифференцированными стволовыми клетками [9].В данном случае ингибирование воспалительной активности, вероятно, является следствием иммуносупрессии циклофосфамидом и АТГ, но удивительно быстрое улучшение структуры и функции артерий может быть связано с ангиогенными свойствами ГСК, как предполагалось в ТГСК при системной склерозе [10]. ].

    Несмотря на то, что у нашего пациента все еще короткий период наблюдения и некоторые артериальные аномалии, обнадеживающие результаты свидетельствуют о том, что высокодозная химио/иммунотерапия, связанная с ТГСК, может изменить клиническое течение тяжелого и рефрактерного васкулита крупных сосудов.

    Мы благодарны многопрофильной команде отделения трансплантации костного мозга больницы Университета Сан-Паулу в кампусе Рибейран-Прету за превосходный уход за пациентом, направляющим врачам Марии Терезе М. Сантос и Серхио С. Комессу, и FAEPA-HCFMRP, FUNDHERP, FAPESP, Министерству здравоохранения, CNPq и FINEP за финансовую поддержку.

    Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

    Каталожные номера

    1

    Johnston SL, Lock RJ, Gompels MM.Артериит Такаясу: обзор.

    Дж. Клин Патол

    2002

    ;

    55

    :

    481

    –6.2

    Bacon PA, Carruthers D. Новые терапевтические аспекты: трансплантация гемопоэтических стволовых клеток.

    Best Practice Res Clin Rheumatol

    2001

    ;

    15

    :

    299

    –13.3

    Fiehn C, Hensel M. Высокодозная химиотерапия с трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток при первичном системном васкулите, болезни Бехчета и синдроме Шегрена. В: Берт Р.К., Мармон А. (ред.).

    Терапия стволовыми клетками при аутоиммунных заболеваниях

    . Джорджтаун, Техас: Landes Bioscience USA,

    2004

    ;

    411

    –18,4

    Вольтарелли Дж.К. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при аутоиммунных заболеваниях в Бразилии: текущее состояние и перспективы на будущее.

    Бюстгальтеры Rev Hematol Hemoter

    2002

    ;

    24

    :

    206

    –11,5

    Voltarelli JC, Ouyang J. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при аутоиммунных заболеваниях в развивающихся странах: текущее состояние и перспективы на будущее.

    Пересадка костного мозга

    2003

    ;

    32

    :

    S69

    –S72.6

    Voltarelli JC, Oliveira MCB, Stracieri APBL, Godoi DF, Moraes DA, Coutinho MA. Аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при артериите Такаясу: отчет о первом случае в литературе.

    Трансплантация костного мозга Биол

    2004

    ;

    10 (Suppl 1)

    :

    62

    .7

    Tyndall A, Koike T. Высокодозная иммуноабляционная терапия с поддержкой гемопоэтическими стволовыми клетками при лечении тяжелых аутоиммунных заболеваний: текущее состояние и будущее направление.

    Интерн Мед

    2002

    ;

    41

    :

    608

    –12,8

    Voltarelli JC, Stracieri AB, Rodrigues MC и др. . Результаты аутологичной ТГСК при тяжелых и рефрактерных аутоиммунных заболеваниях в Бразилии.

    Пересадка костного мозга

    2004

    ;

    33

    :

    S145

    .9

    Берт Р.К., Славин С., Бернс В.Х., Мармон А. Индукция толерантности при аутоиммунных заболеваниях путем трансплантации гемопоэтических стволовых клеток: приближаемся к излечению?

    Кровь

    2002

    ;

    99

    :

    768

    –84.10

    Берт Р.К., Ояма Ю., Трейнор А. и др. . Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при системной склерозе с быстрым улучшением показателей кожи: происходит ли неоангиогенез?

    Пересадка костного мозга

    2003

    ;

    32

    :

    S65

    –S67.

    Примечания автора

    Отделение трансплантации костного мозга и 1 отделение радиологии, отделение клинической медицины, университетская больница (Hospital das Clínicas), медицинский факультет Рибейран-Прету, университет Сан-Паулу, Бразилия

    ревматология, том.43 № 10 © Британское общество ревматологов, 2004 г.; все права защищены

    Можем ли мы узнать больше о патофизиологических механизмах?

    %PDF-1.4 % 1 0 объект > эндообъект 8 0 объект /Заголовок /Тема /Автор /Режиссер /CreationDate (D:20220304083844-00’00’) /ModDate (D:202004228+08’00’) /Версия (1.7) >> эндообъект 2 0 объект > эндообъект 3 0 объект > эндообъект 4 0 объект > эндообъект 5 0 объект > эндообъект 6 0 объект > эндообъект 7 0 объект > поток

  • МикроРНК при ювенильном идиопатическом артрите: можем ли мы узнать больше о патофизиологических механизмах?
  • конечный поток эндообъект 9 0 объект > эндообъект 10 0 объект > эндообъект 11 0 объект > эндообъект 12 0 объект > эндообъект 13 0 объект > эндообъект 14 0 объект > эндообъект 15 0 объект > эндообъект 16 0 объект > эндообъект 17 0 объект > эндообъект 18 0 объект > эндообъект 19 0 объект > эндообъект 20 0 объект > эндообъект 21 0 объект > эндообъект 22 0 объект > эндообъект 23 0 объект > эндообъект 24 0 объект > эндообъект 25 0 объект > эндообъект 26 0 объект > эндообъект 27 0 объект > эндообъект 28 0 объект > эндообъект 29 0 объект > эндообъект 30 0 объект > эндообъект 31 0 объект > эндообъект 32 0 объект > эндообъект 33 0 объект > эндообъект 34 0 объект > эндообъект 35 0 объект > эндообъект 36 0 объект > эндообъект 37 0 объект > эндообъект 38 0 объект > эндообъект 39 0 объект > эндообъект 40 0 объект > эндообъект 41 0 объект > эндообъект 42 0 объект > эндообъект 43 0 объект > эндообъект 44 0 объект > эндообъект 45 0 объект > эндообъект 46 0 объект > эндообъект 47 0 объект > эндообъект 48 0 объект > эндообъект 49 0 объект > эндообъект 50 0 объект > эндообъект 51 0 объект > эндообъект 52 0 объект > /ProcSet [/PDF /Text /ImageC /ImageB /ImageI] >> эндообъект 53 0 объект > поток xڝYˮ6O*FE/hwEϮ$tA1~IQd9eIeq?$XR,&>L_廟Aayk4ɕl4!/[email protected]_\ϴ+dzX/”tǷ[email protected],*’tJ,:&@[email protected];_ tS [email protected]^i0~?oIz_)[email protected]?J#\YGgH̨Ux9:XNM.\=o%~J

    pone.0113465 1..17

    %PDF-1.4 % 1 0 объект > эндообъект 8 0 объект /Заголовок /Тема /Автор /Режиссер /CreationDate (D:20200312065320-00’00’) /ModDate (D:20141203162235+08’00’) >> эндообъект 2 0 объект > эндообъект 3 0 объект > эндообъект 4 0 объект > эндообъект 5 0 объект > эндообъект 6 0 объект > эндообъект 7 0 объект > поток www.plosone.orgfalse10.1371/journal.pone.01134652014-12-17application/pdfdoi:10.1371/journal.pone.0113465

  • pone.0113465 1..17
  • Акробат Дистиллер 9.0.0 (Windows)
  • http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0113465
  • 2014-12-03T16:22:35+08:00Arbortext Advanced Print Publisher 9.0.225/W2014-12-03T16:22:35+08:00uuid:8fc19234-c127-45a7-800b-f896cbf5df68uuid:459eae87-a2d5-4b 9c2e-61a4f672cdcb конечный поток эндообъект 9 0 объект > эндообъект 10 0 объект > эндообъект 11 0 объект > эндообъект 12 0 объект > эндообъект 13 0 объект > эндообъект 14 0 объект > эндообъект 15 0 объект > эндообъект 16 0 объект > эндообъект 17 0 объект > эндообъект 18 0 объект > эндообъект 19 0 объект > эндообъект 20 0 объект > эндообъект 21 0 объект > эндообъект 22 0 объект > эндообъект 23 0 объект > эндообъект 24 0 объект > эндообъект 25 0 объект > эндообъект 26 0 объект > /ProcSet [/PDF /Text /ImageC /ImageB /ImageI] >> эндообъект 27 0 объект > поток xڥYK WW·Q`[email protected][oA]]Ssڿ|vt#3(eIIy XJnkm//k>\k?ss\,K( D8_q3 cz/Z~{9 !#Prs_BlgOOUS(ID¹ĚIDHh(}.