Лекарство нимесулид инструкция: Нимесулид инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Nimesulid таб. 100 мг: 1000 шт. (18253)

Содержание

Нимесулид — таблетки,гель для наружного применения,гранулы для приготовления суспензии для приема внутрь, 100 мг, 1%, 100 мг, инструкция, способ применения и дозы, побочные действия, отзывы о препарате — Энциклопедия лекарств РЛС

Частота побочных реакций: очень часто >1/10; часто >1/100, <1/10; нечасто >1/1000, <1/100; редко >1/10000, <1/1000; очень редко <1/10000, включая отдельные сообщения.

Со стороны крови и лимфатической системы

Редко: анемия, эозинофилия, геморрагии;

Очень редко: тромбоцитопения, панцитопения, пурпура тромбоцитопеническая, удлинение времени кровотечения.

Нарушения со стороны иммунной системы

Редко: реакции гиперчувствительности;

Очень редко: анафилактоидные реакции.

Нарушения психики

Редко: чувство страха, нервозность, ночные «кошмарные» сновидения.

Нарушения со стороны нервной системы

Нечасто: головокружение;

Очень редко: головная боль, сонливость, энцефалопатия (синдром Рейе).

Нарушения со стороны органа зрения

Редко: нечеткость зрения;

Очень редко: нарушение зрения.

Нарушения со стороны органа слуха и лабиринтные нарушения

Очень редко: вертиго.

Нарушения со стороны сердца

Редко: тахикардия, ощущение сердцебиения.

Нарушения со стороны сосудов

Нечасто: повышение артериального давления;

Редко: лабильность артериального давления, «приливы» крови к коже лица.

Нарушения со стороны дыхательной системы, органов грудной клетки и средостения

Нечасто: одышка;

Очень редко: обострение бронхиальной астмы, бронхоспазм.

Нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта

Часто: диарея, тошнота, рвота;

Нечасто: запор, метеоризм, гастрит, желудочно-кишечное кровотечение, язва и/или перфорация желудка или двенадцатиперстной кишки;

Очень редко: боли в животе, диспепсия, стоматит, дегтеобразный стул.

Нарушения со стороны печени и желчевыводящих путей

Часто: повышение активности «печеночных» ферментов;

Очень редко: гепатит, молниеносный (фульминантный) гепатит (включая летальные исходы), желтуха, холестаз.

Нарушения со стороны кожи и подкожных тканей

Нечасто: зуд, кожная сыпь, повышенная потливость;

Редко: эритема, дерматит;

Очень редко: крапивница, ангионевротический отек, отек лица, многоформная эритема, синдром Стивенсона-Джонсона, токсический эпидермальный некролиз (синдром Лайелла).

Нарушения со стороны почек и мочевыводящих путей

Редко: дизурия, гематурия, задержка мочеиспускания;

Очень редко: почечная недостаточность, олигурия, интерстициальный нефрит, гиперкалиемия.

Общие расстройства и нарушения в месте введения

Нечасто: периферические отеки;

Редко: недомогание, астения;

Очень редко: гипотермия.

Нимесулид 100 мг 20 шт. таблетки

Гиперчувствительность, полное или неполное сочетание бронхиальной астмы, рецидивирующего полипоза слизистой носа или околоносовых пазух.

Непереносимость ацетилсалициловой кислоты и других НПВП (в т.ч в анамнезе). Эрозивно-язвенные поражения слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, активное желудочно-кишечное кровотечение, цереброваскулярное или иное кровотечение, воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона, язвенный колит) в фазе обострения.

Гемофилия и другие нарушения свертываемости крови, декомпенсированная хроническая сердечная недостаточность (ХСН).

Печеночная недостаточность или любое активное заболевание печени, гепатотоксические реакции при использовании нимесулида в анамнезе, алкоголизм, наркомания, одновременный прием других гепатотоксических лекарственных средств.

Выраженная хроническая почечная недостаточность (ХПН) (клиренс креатинина менее 30 мл/мин), прогрессирующие заболевания почек, подтвержденная гиперкалиемия.

Период после проведения аортокоронарного шунтирования, беременность, период грудного всасывания, детский возраст до 12 лет.

Непереносимость лактозы, дефицит лактазы или глюкозо-галактозная мальабсорбция.

С осторожностью:

Ишемическая болезнь сердца (ИБС), цереброваскулярные заболевания, хроническая сердечная недостаточность (ХСН), заболевания периферических артерий. Дислипидемия/гиперлипидемия, анамнестические данные о развитии язвенного поражения желудочно-кишечного тракта, наличие инфекции Helicobacter pylori. Длительное использование НПВП, одновременный прием антикоагулянтов (в т.ч. варфарин), антиагрегантов (в т.ч. ацетилсалициловая кислота, клопидогрел), пероральных глюкокортикоидов, селективных ингибиторов обратного захвата серотонина (в т.ч. циталопрам, флуоксетин, пароксетин, сертралин).

Почечная недостаточность (КК 30-60 мл/мин), сахарный диабет, тяжелые соматические заболевания, пожилой возраст, курение.

Беременность и лактация:

Беременностъ

Нимесулид противопоказан во время беременности (риск атонии матки и преждевременного закрытия артериального протока у плода).

Грудное вскармливание

Нимесулид выделяется с грудным молоком. При необходимости лечения препаратом, грудное вскармливание необходимо прекратить.

53 отзыва, инструкция по применению

Нимесулид — нестероидный противовоспалительный препарат (далее — НПВП), селективный ингибитор циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2). Обладает мощным противовоспалительным, обезболивающим и, в меньшей степени, антипиретическим (жаропонижающим) действием. Является одним из самых популярных в России НПВП. Представляет собой эффективное средство для купирования острого болевого синдрома различной этиологии. Согласно рекомендациям ВОЗ НПВП и, в частности, нимесулид, являются препаратами второй линии лечения острой боли, после парацетамола. Механизм действия препарата основан на его способности влиять на обмен арахидоновой кислоты, снижая синтез медиаторов боли и воспаления посредством подавления ЦОГ. Благодаря селективному воздействию на ЦОГ-2 биосинтез цитопротекторных простагландинов в слизистой оболочке желудка не нарушается, что снижает риск развития гастроинтестинальных побочных эффектов. В дополнение к этому, нимесулид снижает активность нейтрофильных гранулоцитов в продуцировании супероксидных анионов, в результате чего снижается количество агрессивных свободных радикалов, которые усугубляют течение воспалительного процесса. На сегодняшний день препарат используют в симптоматической терапии остеоартрита в период обострения боли, при болезненных менструациях, для купирования послеоперационной боли, а также для обезболивания в стоматологической практике. Нимесулид имеет обширную доказательную базу своей эффективности, в том числе — в сравнении с другими лекарственными средствами. Так, в одном из рандомизированных клинических исследований сравнивалась эффективность и безопасность нимесулида и диклофенака. По истечении двухнедельного медикаментозного курса оба препарата показали сопоставимую эффективность с небольшим преимуществом нимесулида. В плане же переносимости превосходство последнего было выражено в большей степени. В еще одном исследовании нимесулиду предстояло выдержать испытание напроксеном. Показателем эффективности в рамках данного исследования было отсутствие или значительное уменьшение болевых ощущений при движении у пациентов, страдающих острым бурситом (воспалением околосуставной сумки) и тендинитом (воспалением связок).

Эффективно купируя боли, оба препарата зарекомендовали себя с самой лучшей стороны без какого-либо значительного преимущества одной из соперничающих сторон. Негативные побочные реакции отмечались, по большей части, со стороны пищеварительного тракта. Их выраженность и частота были выше в группе напроксена. Важно, что нимесулид особенно скрупулезно изучался именно отечественными специалистами. Так, с 1995 года в России было проведено уже более 20 крупных исследований, согласно которым нимесулид либо по всем статьям превосходил, либо ни на йоту не уступал признанным «мэтрам» среди НПВП: существенного улучшения состояния на фоне терапии нимесулидом удалось добиться в среднем у 70% пациентов. Безопасность препарата также находилась на приемлемом уровне: число пациентов с диспепсическими симптомами составило 9,1%, язвы желудочно-кишечного тракта развились у 1,6% пациентов, отмена препарата потребовалась у 1,4% пациентов (препараты сравнения во всех этих случаях продемонстрировали худшие результаты). Это не говорит о том, что нимесулид обладает идеальной переносимостью. Однако его профиль безопасности был значительно более благоприятен, чем у диклофенака, который использовался в качестве препарата активного контроля в большинстве из исследований.

Нимесулид выпускается в форме таблеток. Рекомендуемая доза для взрослых составляет 100-200 мг 2 раза в день, для детей — 1,5 мг на 1 кг массы тела 2-3 раза в день. Помимо прямых противопоказаний, препарат имеет еще ряд ограничений. Так, особую осторожность следует проявлять при назначении нимесулида пациентам, страдающим артериальной гипертензией, почечной и сердечной недостаточностью, расстройствами зрения. Использование нимесулида в педиатрической практике у пациентов в возрасте до 6 лет должно осуществляться под тщательным медицинским контролем.

Нимесулид ингибирует протеинкиназу C-эпсилон и субстанцию ​​P в сенсорных нейронах – сравнение с парацетамолом

Abstract

В этой статье мы описываем новое действие нимесулида и парацетамола на культивируемые периферические нейроны, выделенные из ганглиев задних корешков крыс (DRG). Оба препарата были способны дозозависимым образом снижать количество культивируемых нейронов DRG, демонстрирующих транслокацию протеинкиназы C-эпсилон (PKCɛ), вызванную воздействием 1 мкМ брадикинина или 100 нМ тромбина.Кроме того, измеряли уровень субстанции P (SP), высвобождаемой нейронами DRG, и уровень экспрессии мРНК препротахикинина в исходных условиях и через 70 минут или 36 часов стимуляции фактором роста нервов (NGF) или воспалительным супом, содержащим брадикинин. , тромбин, эндотелин-1 и KCl. Нимесулид (10 мкМ) значительно снижал уровни мРНК препротахикинина, предшественника СП, в исходных и стимулированных условиях, а также уменьшал количество СП, высвобождаемого в среду при стимуляции нейронов NGF или воспалительным супом. Влияние парацетамола (10 мкМ) на такой ответ было ниже. Нимесулид полностью ингибировал высвобождение простагландина Е2 (PGE2) из ​​нейронов DRG, либо базальное, либо индуцированное NGF и воспалительным бульоном, в то время как парацетамол снижал высвобождение PGE2 лишь частично. Наши данные впервые демонстрируют прямое влияние двух препаратов, широко используемых в качестве анальгетиков, на нейроны DRG. Настоящие результаты позволяют предположить, что PKCe может быть мишенью для действия нимесулида и парацетамола, в то время как ингибирование синтеза и высвобождения SP явно более актуально для нимесулида, чем для механизма действия парацетамола.

Ключевые слова: ноцицепторы, анальгезия, гипералгезия, спинномозговые ганглии, PKCɛ

Введение

В данной статье мы представляем сравнительное исследование механизмов действия нимесулида и парацетамола, препаратов, широко применяемых в качестве анальгетиков, на культивируемых спинномозговых корешках крыс. нейроны ганглиев (DRG).

Нимесулид — нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП) с широким спектром действия на воспаление и другие биохимические процессы, приводящий к многофакторному механизму действия. 1 Нимесулид является предпочтительным ингибитором циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) 1 4 , но его противовоспалительное и обезболивающее действие также включает активность в отношении широкого спектра медиаторов воспаления и боли и внутриклеточных путей 1 , 5 включая влияние на синовиальную концентрацию субстанции P (SP) у пациентов с остеоартрозом коленного сустава. 6 В то время как некоторые доказательства обезболивающего действия нимесулида были связаны с действием на центральную нервную систему, 7 , насколько нам известно, о прямом воздействии нимесулида на изолированные сенсорные нейроны еще не сообщалось.

Парацетамол является одним из самых популярных и часто используемых препаратов для лечения умеренной боли, которая до сих пор представляет собой проблему с точки зрения удовлетворительного объяснения его хорошо известных эффектов. Несмотря на свою жаропонижающую и обезболивающую активность, он почти не оказывает противовоспалительного действия и является слабым ингибитором ЦОГ-1 или ЦОГ-2. 8 , 9 Было предложено участие нескольких возможных механизмов на различных уровнях ноцицептивного пути от периакведуктального серого до периферического. 10 16

Эпсилон-изоформа протеинкиназы С (PKCɛ) является очень важным периферическим эффектором ряда медиаторов воспаления, включая брадикинин, простагландины, протеазы, прокинетики, SP и др., 16 21 , который вызывает повышенную активацию ноцицепторов за счет действия на временный рецепторный потенциал ваниллоидного члена 1 (TRPV1) и на нечувствительные к тетродотоксину (ТТХ) натриевые каналы. 22

Нейропептид SP уже давно ассоциируется с передачей вредных раздражителей. 23 В периферической нервной системе он экспрессируется в подмножестве немиелинизированных ноцицептивных сенсорных нейронов и транспортируется к центральным и периферическим окончаниям аксонов. В центре SP высвобождается в поверхностной пластинке заднего рога спинного мозга, тогда как на периферии он участвует в нейрогенном воспалении. 24 26 Несмотря на его важность в передаче боли, мало что известно о модуляции SP противовоспалительными и обезболивающими препаратами.

В этой статье мы исследуем в культивируемых нейронах DRG способность нимесулида и парацетамола снижать транслокацию PKCɛ, снижать синтез препротахикинина и высвобождение SP, индуцированное медиаторами воспаления, а также снижать простагландин E 2 (PGE 2 ) освобождение от активированных нейронов. Мы показываем, что у нимесулида и парацетамола есть некоторые новые механизмы действия, потенциально связанные с их эффектами in vivo, хотя другие эффекты наблюдаются исключительно или количественно сильнее при лечении нимесулидом.

Материалы и методы

Первичные культуры спинномозговых ганглиев

Крыс Sprague Dawley (возраст 2–3 недели) умерщвляли под общей анестезией в соответствии с итальянским и европейским законодательством с протоколами, согласованными с рекомендациями Комитета по исследованиям и этике. Вопросы ИАСП. 27 Экспериментальная работа также была рассмотрена и одобрена местным комитетом по уходу и использованию животных. Собирали DRG, инкубировали в течение 1 часа при 37°C с 0.125% коллагеназы (Worthington, Freehold, NJ) и механически диссоциировали, высевали на покровные стекла или чашки Петри, предварительно обработанные 10 мкг/мл поли-L-лизина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и 20 мкг/мл ламинина (Sigma -Aldrich, Милан, Италия) и культивировали в среде DMEM, содержащей 1% пенициллин/стрептомицин, 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), 1,5 мкг/мл цитозина 1-d-арабинофуранозида ( ARA-C, Sigma), как описано ранее. 28 Нейроны, используемые для иммуноцитохимических экспериментов, культивировали в присутствии 100 нг/мл фактора роста нервов (NGF) (Sigma) для улучшения экспрессии рецепторов брадикинина и тромбина. 29

Иммуноцитохимия

PKCɛ визуализировали, как описано ранее. 18 , 19 Вкратце, крысиные DRG-нейроны, культивированные в течение 2–3 дней in vitro, обрабатывали брадикинином (BK, в концентрации 1 мкМ) или тромбином (THR, 100 нМ) в течение 30 секунд и быстро фиксировали. в течение 10 минут при комнатной температуре с параформальдегидом (4% формальдегида и 4% сахарозы, растворенных в фосфатно-солевом буфере (PBS)/дистиллированная вода 2:1). С помощью автоматизированной системы (FSC-1, CV Scientific, Модена, Италия) наносили растворы для стимуляции, а затем раствор для фиксации.В тестовых экспериментах нимесулид или парацетамол (от Sigma) в различных концентрациях предварительно наносили на 120 минут или на ночь (см. ), а также добавляли к BK и THR, нанесенным на покровные стекла. Диметилсульфоксид (ДМСО) использовали для приготовления исходных растворов нимесулида и парацетамола, а конечная концентрация ДМСО, нанесенного на клетки, всегда была ниже 1:1000. Фиксированные клетки трижды промывали в PBS (с 0,1% желатином рыбьей кожи для блокирования неспецифических участков), пермеабилизировали в течение 30 минут при комнатной температуре с Triton X-100 (0.2% в PBS) и инкубировали в течение ночи при 4°C с поликлональным антителом против PKCɛ 17 , разбавленным 1:1000 в PBS-T/желатине (PBS с 0,05% Triton X-100). Затем покровные стекла инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с козьим антикроличьим IgG, конъюгированным с флуорофором Alexa Fluor 488 (1:200; Invitrogen), трижды промывали в PBS/желатине и визуализировали с помощью конфокального микроскопа (Leica SP2, Leica, Швейцария). ). Активация PKCɛ приводит к транслокации из полностью цитоплазматического местоположения в мембрану нейронных клеток (см. ).Транслокацию количественно определяли путем определения интенсивности флуоресценции вдоль линии, расположенной поперек клетки так, чтобы избежать ядра (подробности см. Cesare et al. 17 ). Нейроны, в которых интенсивность на клеточной мембране была по крайней мере в 1,5 раза больше, чем средняя цитоплазматическая интенсивность, считались положительными.

Нимесулид и парацетамол ингибируют транслокацию протеинкиназы C-эпсилон (PKCɛ) в сенсорных нейронах ганглиев задних корешков (DRG). ( A B ) Конфокальные изображения нейронов DRG, обработанных брадикинином (BK, 1 мкМ) в течение 30 секунд, а затем зафиксированных и окрашенных на PCKɛ специфическим антителом. ( A ) типичное поведение неотвечающего нейрона. ( B ) типичный BK-чувствительный нейрон, демонстрирующий транслокацию PKCɛ на плазматическую мембрану. Нейроны, обработанные 100 нМ тромбином (THR) в течение 30 секунд, будут демонстрировать аналогичное поведение. Нейроны, фиксированные без предварительной обработки BK или THR, не проявляли признаков спонтанной транслокации. Масштабная линейка 10 мкм. ( C ) Процент нейронов, демонстрирующих транслокацию PKCɛ, индуцированную 1 мкМ BK или ( E ) 100 нМ THR, значительно снижался за 2 часа до применения нимесулида в концентрации 1 или 10 мкМ.Ночная обработка (OVN) не приводила к большему ингибированию ( C E ). При лечении парацетамолом только самая большая концентрация испытанного препарата (10 мкМ) значительно снижала транслокацию, индуцированную BK ( D ) или THR ( F ). Дальнейшие пояснения в тексте. Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего, полученные для 4–12 культур.

Примечания: * P < 0,05, ** P < 0,01 и *** P < 0,001 по сравнению с контролем.

Стимуляция спинномозговых ганглиев и медикаментозное лечение

Через 2–3 дня in vitro культуры DRG стимулировали для экспериментальных процедур с использованием либо NGF (100 нг/мл), либо смеси воспалительных/проалгетических медиаторов (воспалительный суп, IS) из следующий состав: 1 мкМ BK, 100 нМ THR, 100 нМ эндотелин-1, 25 мМ KCl, растворенные в нормальной культуральной среде (DMEM + 10% FBS). При необходимости 10 мкМ тестируемых химических веществ (нимесулид или парацетамол, от Sigma), растворенных в ДМСО, предварительно наносили на 30 минут перед обработкой NGF и IS, что считалось достаточным временем для полного проявления их эффекта до применения медиаторы воспаления.

Клетки стимулировали либо NGF, либо IS с лекарствами или без них в течение 70 минут и 36 часов. В конце этих периодов инкубации среду и клетки собирали для дальнейшей обработки, как описано ниже.

Измерение SP и PGE

2 в культуральной среде

Количественное определение PGE 2 проводили с помощью иммуноферментного анализа с использованием имеющегося в продаже набора EIA (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI). Чувствительность набора ПГЕ -2- для ИФА составила 15 пг/мл.

Для измерения SP культуральные среды подкисляли 1 н. уксусной кислотой, и SP измеряли с помощью радиоиммуноанализа (РИА) с использованием антисыворотки и ранее описанных и проверенных методов. 30 , 31 Антитело было получено у кролика против синтетического SP и было направлено к С-концу пептида. I 125 -SP был куплен у Perkin Elmer (Монца, Италия). Чувствительность РИА составляла 10 пг/пробирку, а коэффициенты вариации внутри и между анализами составляли 8% и 11% соответственно.

Выделение РНК и ОТ-ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК из клеток DRG очищали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Life Technologies, Сан-Джулиано-Миланезе, Италия). Клетки лизировали непосредственно в чашке для культивирования в соответствии с инструкциями производителя, а РНК ресуспендировали в 8 мкл воды. После очистки общие концентрации РНК определяли по величине поглощения образца при 260 нм. Тотальную РНК (300 нг) обрабатывали ДНКазой (Ambion без ДНК), чтобы избежать ложноположительных результатов из-за амплификации загрязняющей геномной ДНК.кДНК первой цепи синтезировали из 1000 нг общей РНК в конечном объеме 20 мкл с использованием M-MLV RT (обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей Moloney; Invitrogen, Сан-Джулиано-Миланезе, Италия). кДНК (2 мкл) подвергали количественной ПЦР в реальном времени с использованием ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Forster City, CA). ПЦР TaqMan проводили в объеме 25 мкл с использованием зонда Real Master Mix Probe ROX (Eppendorf, Гамбург, Германия). Специальные зонды были подготовлены компанией Applied Biosystems. Зонды были такими же, как и в предыдущем исследовании 31 , и были сконструированы так, чтобы охватывать интрон, чтобы избежать потенциальной амплификации геномной ДНК в анализируемых образцах. Зонды были помечены на 5′-конце 6-карбоксифлуоресцеином и на 3′-конце 6-карбокситетраметилродамином. Праймеры и последовательность зонда для препротахикинина (PPT, инвентарный номер Genbank {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”M15191″,”term_id”:”206341″}}M15191) и GAPDH (инвентарный номер Genbank {“type”:”entrez-нуклеотид”,”attrs”:{“text”:”AF106860″,”term_id”:”101“}}AF106860) показан в Bianchi et al. 31 Все анализы ПЦР проводились в двух повторах. Прежде чем использовать метод ΔΔCT для относительного количественного определения, мы провели проверочный эксперимент, чтобы продемонстрировать, что эффективность двух разных зондов (целевого и эталонного) одинакова.Условия реакции были следующими: 95°С в течение 2 минут, затем 40 циклов при 95°С в течение 15 секунд (денатурация) и 60°С в течение 1 минуты (отжиг и удлинение). В качестве контроля использовали реакционную смесь без кДНК. Пороговые числа циклов (CT) определяли с помощью системы обнаружения последовательностей ABI PRISM 7000 (программное обеспечение версии 1. 1) и преобразовывали с использованием сравнительного метода ΔCT (2-ΔΔCT). Значения экспрессии, специфичной для гена, нормализовали к значениям экспрессии GAPDH (эндогенный контроль) в каждом образце.Уровни препротахикинина выражали относительно значений калибратора в контрольных клетках. Относительную количественную оценку проводили с использованием сравнительного метода. Количество мишени, нормализованное к эндогенному эталону и относительно калибратора, определяется 2-ΔΔCT. Вкратце, значение ΔCT определяют путем вычитания среднего значения GAPDH CT из среднего значения PPT CT в том же образце. Расчет ΔΔCT включает вычитание калибровочного значения ΔCT.

Статистический анализ

Данные были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим применением теста Бонферрони t для множественного сравнения.Эффект считался значительным, если значение P было меньше 0,05.

Результаты

Влияние на транслокацию PKCɛ

Активация PKCɛ медиаторами воспаления приводит к ее транслокации из цитоплазмы на поверхностную мембрану сенсорных нейронов DRG, что можно визуализировать непосредственно с помощью иммуноцитохимии и конфокальной микроскопии (). 18 , 19 , 21 Транслокация PKCɛ может быть определена количественно по количеству нейронов, в которых наблюдается транслокация – с помощью этого подхода можно получить надежные кривые доза-реакция и зависимость от времени. 19 , 21 После применения 1 мкМ BK или 100 нМ THR, которые являются насыщающими концентрациями для этих агонистов, неизменно наблюдалась максимальная транслокация. Как показано ранее, при более длительном применении PKCɛ медленно интернализировался в перинуклеарные везикулы. 17 , 19 , 21 Поскольку максимальная транслокация постоянно наблюдалась при вышеуказанных концентрациях агониста и при 30-секундном воздействии, эти параметры были приняты для всех последующих экспериментов.BK наносили на культуры DRG на 30 секунд в концентрации 1 мкМ, после чего быстрая фиксация вызывала транслокацию в 30,8% ± 2% нейронов новорожденных крыс, культивируемых в присутствии NGF. THR вызывал транслокацию в 17,8% ± 1% нейронов DRG новорожденных крыс, также культивируемых в присутствии NGF.

Как показано на , количество нейронов, в которых 1 мкМ BK индуцировала транслокацию, значительно уменьшилось за 2 часа до применения нимесулида (10 мкМ) до значения 17,9% ± 1,1% по сравнению с нейронами, предварительно обработанными раствором носителя ( P < 0.001). Транслокация также значительно снижалась при 10-кратном снижении концентрации нимесулида (1 мкМ) до 22,9% ± 2,5%, а эффективность была значительно ниже по сравнению с 10 мкМ нимесулида ( P <0,05), что указывает на дозозависимый эффект нимесулида. зависимый. Нимесулид оказывал в значительной степени схожие эффекты на транслокацию PKCe, индуцированную 100 нМ THR (12), и в этом случае ингибирование было статистически значимым, хотя существенно не различалось при концентрациях 10 мкМ (11,1 ± 1,4) и 1 мкМ (12.5 ± 1,7), которые предварительно наносили за 2 часа до эксперимента. Более длительное предварительное применение нимесулида в дозе 10 мкМ (ночь, а не 2 часа) не вызывало большего ингибирования транслокации как для BK (14,3% ± 1,7%), так и для THR (10,4% ± 1,2%), как показано на рис. Более короткая предварительная аппликация нимесулида в течение 15 минут в концентрации 10 мкМ не вызывала существенных различий по сравнению со 120-минутной аппликацией, и в этом случае 1 мкМ БК вызывал транслокацию в 17,4 ± 0,5% и 100 нМ ТГР в 9,6% ± 1.2% нейронов (на рисунке не показаны).

Влияние парацетамола на транслокацию PKCɛ исследовали с использованием того же протокола, что и для нимесулида. Как было показано, парацетамол был менее эффективен, чем нимесулид, потому что только самая высокая протестированная концентрация значительно снижала процент перемещенных нейронов. В то время как нимесулид в дозе 10 мкМ вызывал процент снижения транслокации, индуцированной BK и THR, на ~42% и ~38%, парацетамол в той же концентрации вызывал снижение на ~23% и ~34% соответственно.Эффект парацетамола, как и нимесулида, не усиливался при предварительном применении на ночь.

Влияние на синтез мРНК препротахикинина

SP синтезируется из предшественника PPT. мРНК РРТ количественно определяли в культурах DRG с использованием ПЦР в реальном времени. 31 В качестве исходного уровня мы использовали культуры без лечения и без добавления факторов роста через 60 часов после посева, в это время соответствующие уровни мРНК PTT постоянно превышали минимальные уровни для обнаружения.Уровни PPT были значительно повышены по сравнению с контролем через 36 часов лечения NGF (100 нг/мл) или смесью провоспалительных и проалгетических агентов, которые мы назвали IS (см. Материалы и методы). Оба вида лечения были эффективны в различных испытаниях, а активация ИС увеличивала уровни мРНК примерно в 2,9 раза по сравнению с контролем, в то время как увеличение, вызванное NGF, колебалось от 1,7 до 2,9 по сравнению с контролем (см. Ресурсы).

Влияние нимесулида и парацетамола (10 мкМ) на экспрессию мРНК препротахикинина (PPT) в культивируемых нейронах ганглиев задних корешков в исходных условиях и после 36-часовой обработки воспалительным супом (IS) и фактором роста нервов (NGF).Количество PPT нормализовали к GAPDH путем вычитания среднего значения числа циклов GAPDH (CT) из среднего PPT CT, а затем применяли сравнительный метод (2-ΔΔCT) с использованием необработанных клеток в качестве калибратора (контроль).

Примечания: Значения являются средними ± стандартная ошибка среднего для 4–6 экспериментов. # = P <0,05 по сравнению с контролем; * = P <0,05 по сравнению с соответствующими стимулированными культурами.

Сокращения: P, парацетамол; Н, нимесулид.

Обработка нимесулидом (10 мкМ), примененная через 24 часа после посева в течение 36 часов, значительно снизила базальный уровень мРНК PPT по сравнению с необработанными нейронами.Нимесулид также значительно снижал активацию мРНК ППТ, вызванную ИИ и ФРН, соответственно на ~40 и ~60% (1).

Эффекты парацетамола () были несколько иными: в дозе 10 мкМ через 36 часов лечения он не вызывал каких-либо изменений базовых уровней экспрессии мРНК РРТ и значительно снижал активацию ИС (примерно на 40%), в то время как активацию ФРН лечение не изменило. И нимесулид, и парацетамол применялись предварительно в течение 30 минут для полного проявления эффекта до лечения ИС и ФРН.

Влияние на базальное и стимулированное выделение субстанции Р в среде

Уровни СП, высвобождаемого в среду культивируемыми нейронами ДРГ, оценивали радиоиммунологическим методом (см. Материалы и методы). Приблизительно через 24 часа после посева отдельные покровные стекла из одних и тех же культур DRG обрабатывали нимесулидом, парацетамолом (оба 10 мкМ), с или без NGF (100 нг/мл) или IS, или с носителем, всего в 6 отдельных условиях. (). Покровные стекла, подвергшиеся обработке, содержащей нимесулид или парацетамол, предварительно обрабатывали той же концентрацией этих препаратов в течение 30 минут, а контрольные покровные стекла обрабатывали средой-носителем в течение того же времени.Описанные обработки оставались на покровных стеклах либо 70 минут (), либо 36 часов (), затем среду удаляли и хранили при –80°C до измерения SP.

Влияние нимесулида и парацетамола (10 мкМ) на высвобождение вещества P (SP), измеренное в культуральной среде из нейронов DRG в исходных условиях и через 70 минут ( A , B ) и 36 часов ( C , D ) лечение воспалительным супом (IS) и фактором роста нервов (NGF).

Примечания: Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего для 4–6 экспериментов и выражены в % от контрольных культур.# = P <0,05 по сравнению с контролем; * = P <0,05 по сравнению с соответствующими стимулированными культурами.

Сокращения: P, парацетамол; Н, нимесулид.

Ни нимесулид, ни парацетамол не изменяли базальные уровни высвобождения SP, которые составляли примерно 30 ± 2,19 (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) пг/мл среды через 70 минут и 77 ± 11 (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) пг/мл среды через 36 часов.

Обработка как NGF, так и IS значительно увеличивала уровень SP в среде через 70 минут и через 36 часов ( ).Такое высвобождение было значительно уменьшено нимесулидом (1), но не было изменено парацетамолом, который был совершенно неэффективен (2). Эффект нимесулида был значительным через 70 минут и был особенно сильным через 36 часов, так как высвобождение SP, вызванное NGF и IS, было полностью ингибировано и снижено до значений, в значительной степени идентичных базальным уровням.

Влияние на высвобождение PGE

2 в среде

PGE 2 количественно определяли в культурах DRG с использованием EIA (см. ). 31 , 32 В культуральной среде практически не было ПГЕ 2 , так как 10% фетальной бычьей сыворотки, добавленной к DMEM, были лишь следовыми количествами (см. методы).Приблизительно через 24 часа после посева среду меняли и культуры обрабатывали либо носителем, либо IS, NGF, нимесулидом или парацетамолом (10 мкМ) или без них. Через 70 минут или 36 часов обработки среду собирали и измеряли PGE 2 , высвобождаемый культурами в течение этого времени. Базальное высвобождение нестимулированными культурами DRG в разных сериях экспериментов варьировало от 199 ± 41 до 337 ± 37 пг/мл через 70 минут и от 1,5 ± 0,5 до 1,7 ± 0,5 нг/мл через 36 часов.Уровни PGE 2 были значительно повышены по сравнению с контролем через 70 минут или 36 часов обработки NGF или IS. Оба препарата были эффективны в различных испытаниях, и ИС увеличивал уровни PGE 2 примерно в 1,6–2,3 раза по сравнению с контролем, в то время как увеличение NGF колебалось в 1,5–2,0 раза через 70 минут; увеличение колебалось между 4,8- и 7,4-кратным (IS) и 4,6- и 4,2-кратным (NGF) через 36 часов по сравнению с контрольными уровнями (см.) в различных группах экспериментов.Обработка нимесулидом (10 мкМ), примененная через 24 часа после посева в течение 70 минут или 36 часов (), полностью ингибировала базальные уровни PGE 2 , высвобождаемые в среде, по сравнению с необработанными нейронами (снижение почти на 100%). Лечение нимесулидом также полностью ингибировало высвобождение PGE 2 , вызванное ИС и ФРН. Как через 70 минут, так и через 36 часов нимесулид снижал уровень PGE 2 до уровней, сходных с теми, которые присутствовали в среде до его добавления к культурам (1).

Влияние нимесулида и парацетамола (10 мкМ) на высвобождение простагландина E 2 (PGE 2 ), измеренное в культуральной среде из нейронов ганглиев задних корешков в исходных условиях и через 70 минут ( A , B ) и 36 часов ( C , D ) лечения воспалительным супом (IS) и фактором роста нервов (NGF).Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка M для 4–6 экспериментов.

Примечания: # = P < 0,05 по сравнению с контролем; * = P <0,05 по сравнению с соответствующими стимулированными культурами.

Сокращения: P, парацетамол; Н, нимесулид.

Парацетамол () (10 мкМ) снижал базальные уровни PGE 2 как через 70 минут, так и через 36 часов. Точно так же высвобождение PGE 2 , индуцированное ИС, было значительно снижено парацетамолом как через 70 минут, так и через 36 часов.Иными словами, высвобождение PGE 2 , индуцированное NGF, значительно снижалось под действием парацетамола через 70 минут, в то время как снижение через 36 часов (около 30%) не достигало статистической значимости.

Обсуждение

Специфическое участие PKCɛ в сенсибилизации ноцицепторов и гипералгезии описано во многих сообщениях. После первой статьи Cesare et al., 17 , показывающей, что сенсибилизация индуцированных теплом токов брадикинином в ноцицептивных нейронах опосредована PKCɛ, ряд исследований подтвердил важность, участие и необходимость этого фермента при воспалительной боли и ноцицепции. на клеточном и общеживотном уровне. 22 , 33 , 34 PKCɛ преимущественно экспрессируется в ноцицептивных нейронах, где он играет решающую роль при хронической повышенной возбудимости, но его ингибирование вызывает незначительные нарушения нормальной сенсорной функции или других функций. 34 PKCɛ, таким образом, в настоящее время представляет собой не только хорошо проверенную мишень для лечения воспалительной и невропатической боли в доклинической научной литературе 35 , 36 , но также новую и привлекательную мишень для терапевтического вмешательства у пациентов-людей.В этом свете наше новое обнаружение ингибирования транслокации PKCe нимесулидом и, хотя в меньшей степени, парацетамолом, по-видимому, имеет большое значение для лучшего понимания механизмов действия этих препаратов. В настоящее время ведется работа по изучению того, является ли вмешательство в транслокацию PKCɛ общей чертой других НПВП и анальгетиков. Ингибирование PKCe нимесулидом, парацетамолом или, возможно, другими НПВП и анальгетиками может быть важной частью их фармакологического действия.

Простагландины действуют не только как медиаторы, которые непосредственно активируют нижележащие каскады, ведущие к сенсибилизации ноцицепторных ионных каналов, но также функционируют как паракринные медиаторы при сенсибилизации ноцицепторов другими воспалительными агентами (глутамат, брадикинин, тромбин и т. д.). Простагландины могут продуцироваться воспаленными тканями и лейкоцитами, участвующими в воспалении, а также сенсорными нейронами и периферическими глиальными клетками. Примечательно, что в культурах ДРГ, как в ДРГ, так и в окончаниях периферических нервов, отмечается значительное присутствие периферических глиальных клеток (сателлитных клеток и шванновских клеток), количество которых, несмотря на наличие ингибитора репликации клеток АРА-С (см. Материалы и методы), находится как минимум в соотношении 10:1 по сравнению с нейронами.Эти клетки экспрессируют многие рецепторы медиаторов воспаления, экспрессируемые ноцицепторами, и высвобождают простагландины, а также другие медиаторы, включая эндоканнабиноиды 37 или цитокины. 38 Высвобождение PGE 2 из культур DRG 39 может быть связано с высвобождением из этих ненейронных клеток. Фактически, в предварительных экспериментах (здесь не показаны) мы обнаружили большое высвобождение PGE 2 культурами ненейрональных периферических глиальных клеток после обработки медиаторами воспаления.Таким образом, эффекты ингибирования высвобождения PGE 2 из культур DRG нимесулидом и парацетамолом, описанные в этой статье, могут быть связаны с ингибированием ненейрональных и нейрональных ЦОГ. Как ЦОГ-1, так и ЦОГ-2 экспрессируются в нейронах DRG, при этом ЦОГ-1 особенно экспрессируется в сенсорных нейронах небольшого размера, 40 , в то время как идентичность ЦОГ, экспрессируемых в периферической глии, менее ясна. 39 , 41

Культуры DRG высвобождали значительные количества PGE 2 , которые очень быстро увеличивались при добавлении в среду IS и NGF.Блокирующий эффект нимесулида в используемой концентрации (10 мкМ) оказался максимальным, так как нимесулид полностью подавлял как базальный, так и индуцированный синтез ПГЕ 2 в культурах ДРГ. Напротив, ингибирование высвобождения PGE 2 , вызванное парацетамолом, было значительно меньше по сравнению с эффектом нимесулида, что согласуется с современными знаниями о фармакологии парацетамола и механизмах его действия.

Периферическая воспалительная боль связана со сложной картиной локальных изменений, и после повреждения тканей активируются многие проноцицептивные и провоспалительные медиаторы; они снижают ноцицептивные пороги и повышают возбудимость нейронных мембран, что приводит к гиперноцицепции. 42 , 43 Нейропептид SP присутствует в С-волокнах, синтезируется в ДРГ и транспортируется как к центральным, так и к периферическим окончаниям первичных афферентных нейронов. В центральной нервной системе SP играет решающую роль в сенсибилизации спинных нейронов. На периферии SP вызывает вазодилатацию, повышает чувствительность к ноцицептивным стимулам и способствует нейрогенному воспалению. 24 Кроме того, SP может непосредственно активировать иммунные клетки, индуцируя хемотаксис моноцитов/макрофагов и продукцию различных провоспалительных цитокинов. 30 , 44 , 45 Эти эффекты способствуют распространению сенсибилизации, ведущей к вторичной гипералгезии. Таким образом, контроль как центрального, так и периферического высвобождения SP является важным шагом в определении порога восприятия боли при гипералгезии во время воспаления.

При стимуляции ноцицепторов SP высвобождается в результате очень сложного процесса, включающего несколько важных внутриклеточных эффекторов, таких как приток внеклеточного кальция, высвобождение кальция, индуцированное 1-4-5 инозитолтрифосфатом, активацию ERK, PKA, ЦОГ и простагландинов.Чтобы вызвать синтез и высвобождение SP, мы использовали два разных стимула: NGF и смесь медиаторов воспаления (IS), которые использовались вместе, чтобы имитировать воспалительный бульон, присутствующий в воспаленной ткани. Оба стимула являются мощными активаторами SP, поскольку мы наблюдали значительное увеличение высвобождения SP уже через 70 минут стимуляции, в то время как, как и ожидалось, для активизации синтеза препротахикинина требовалось больше времени.

Похоже, что, хотя стимул IS индуцировал повторяющееся и постоянное увеличение высвобождения как препротакикинина мРНК, так и SP в различных экспериментах, модуляция системы SP с помощью NGF, хотя и присутствовала всегда, отличалась в разных культурах.Вполне вероятно, что ИС, состоящий из 3 различных провоспалительных агентов, более эффективен, чем NGF, поскольку он активирует несколько путей и вызывает почти максимальную стимуляцию системы. С другой стороны, эффект NGF может быть более чувствительным к небольшим изменениям экспериментальных условий в разных сериях экспериментов, таких как возраст животных и разные месяцы года, в которые проводились эксперименты, что могло повлиять на исходное состояние. активации клеток DRG и/или относительный процент нейронов и глиальных клеток, экспрессирующих рецепторы NGF в культурах.Несмотря на эти количественные различия в амплитуде ответа NGF, эффекты тестируемых препаратов оказались в значительной степени схожими и согласовывались с другими наборами экспериментов.

Наши данные показывают, что увеличение синтеза и высвобождения SP, вызванное ИС и ФРН, значительно снижалось нимесулидом, но не парацетамолом (2). Нимесулид также снижал базальные уровни мРНК ППТ, но опять же не парацетамол. Учитывая систему in vitro, которую мы использовали в нашем эксперименте, и быстрое начало эффекта, ингибирование высвобождения и продукции SP, вероятно, связано с прямым действием нимесулида на ноцицепторы.

Таким образом, наши настоящие данные предполагают, что чувствительные нервные волокна могут быть мишенью для действия нимесулида, и указывают на важное участие SP в эффектах нимесулида, указывая на дополнительный механизм действия помимо его хорошо известного ингибирования периферической ЦОГ-2. Напротив, модуляция уровней SP, по-видимому, не является частью эффектов парацетамола.

Эти наблюдения добавляют другие элементы к растущему числу эффекторов, на которые нацелен нимесулид, подтверждая многофакторную основу действия нимесулида.Детали механизмов, с помощью которых нимесулид вызывает снижение как синтеза, так и высвобождения SP, еще предстоит выяснить. В настоящее время мы можем только предположить, что ингибирование ЦОГ-1/2, присутствующее в клетках DRG, как обсуждалось выше, приводящее к снижению продукции PGE 2 , может, по крайней мере частично, опосредовать модулирующий эффект нимесулид по сп. Несмотря на вклад нимесулид-индуцированного простагландина, снижение ингибирования высвобождения SP возможно, но вряд ли это является единственным ответственным механизмом.На самом деле парацетамол также может вызывать значительное ингибирование простагландинов, но это не сопровождается каким-либо снижением высвобождения SP из DRG (и ). Интересно, что недавно было высказано предположение, что активация канала TRPV1 является сильным стимулом для синтеза и высвобождения SP. 46 Поскольку сенсибилизация TRPV1 частично связана с PKCɛ-зависимым фосфорилированием, можно предположить, что нимесулид может подавлять SP во время снижения транслокации PKCɛ.Более того, связывание SP с его рецепторами NK-1 в первичных сенсорных нейронах усиливает активность TRPV1 через PKCɛ. 20 Таким образом, мы можем представить себе механизм положительной обратной связи, при котором SP, простагландин, TRPV1 и PKCɛ действуют параллельно и способствуют индукции и поддержанию воспалительной гипералгезии.

С другой стороны, учитывая, что парацетамол также является слабым ингибитором PKCɛ, но не влияет на SP, мы не можем исключить возможность того, что ингибирование транслокации и уменьшение высвобождения SP не связаны друг с другом.Однако эффекты нимесулида на несколько важных взаимодействующих медиаторов могут быть важны не только для контроля острой гипералгезии, но и для предотвращения прогрессирования воспалительной гипералгезии в хроническую форму. В предыдущем исследовании концентрации нимесулида в плазме оценивали у пациентов после 2 недель лечения активной дозой препарата. Интересно, что измеренные уровни нимесулида в плазме находились строго в диапазоне концентраций, использованных в настоящем исследовании in vitro, что еще раз указывает на его значимость для эффектов препарата in vivo. 47

Исследуемое в данной статье действие парацетамола и нимесулида проявляется в периферической нервной системе. Мы должны помнить, что in vivo в действие этих препаратов может быть вовлечено большое количество активностей в отношении нескольких различных мишеней, и они могут быть важны при различных болезненных состояниях. Супраспинальные эффекты, хорошо описанные для парацетамола, 48 , вероятно, ответственны за большую часть его анальгетической активности. Напротив, центральные механизмы нимесулида, участвующие в его обезболивающем и противовоспалительном действии, менее изучены.Мы также знаем, что наша модель in vitro особенно характерна для воспалительной гипералгезии, и что необходима дальнейшая работа, чтобы оценить роль путей, которые мы изучали, в других болезненных состояниях, таких как невропатическая боль.

Нимесулид-индуцированная фиксированная лекарственная сыпь | Аллергология и иммунопатология

ВВЕДЕНИЕ

Фиксированные лекарственные высыпания (FDE), впервые описанные Brocq в 1894 г., состоят из повторяющихся высыпаний, которые могут поражать любую часть кожи и/или слизистых оболочек, характеризующихся резко очерченными, округлыми, эритематозными или фиолетовыми бляшками, которые различаются в размере, возникающем после приема провинциального препарата 1-3.Впоследствии могут развиваться везикулы и буллы с образованием корок. 4. Генерализованная буллезная фиксированная лекарственная сыпь — редкое и тяжелое состояние, требующее дифференциальной диагностики с токсическим эпидермальным некролизом и буллезной пемфигой d5.

Диагностическим признаком является рецидив на ранее пораженных участках при повторном приеме подозреваемого наркотика 2,3. Когда острая фаза стихает, обычно остается остаточная гиперпигментация, которая становится более выраженной после каждого рецидива 4.

ФДЭ — распространенные кожные лекарственные реакции, часто неправильно диагностируемые, возникающие в любом возрасте, хотя чаще у молодых людей 4.Они ответственны за 10 % всех побочных реакций на лекарства 6.

В настоящее время известно, что многие лекарства могут вызывать ФДЭ, но некоторые, по-видимому, встречаются чаще. Наиболее распространенными лекарственными препаратами являются антибиотики, а именно сульфаниламиды, и нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) 1,2,7.

Насколько нам известно, в литературе описано только восемь случаев ФДЭ, вызванных нимесулидом 8,9.

КЛИНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ

Мы сообщаем о случае 41-летнего здорового мужчины, обратившегося в нашу клинику лекарственной аллергии по поводу нескольких эпизодов крапивницы и отека губ после приема лекарств.

Он сообщил о 2 эпизодах крапивницы на нижней части спины и ногах и отека губ через 12 часов после приема оксатомида (30 мг). Через год произошел аналогичный эпизод, на этот раз с преимущественным поражением правой ноги, после приема внутрь цефиксима (400 мг), нимесулида (100 мг) и парацетамол-кофеин-бромфенираминной комбинации. Все эпизоды разрешились спонтанно после отмены препарата.

Для оценки альтернативных вариантов лечения были проведены кожные прик-тесты (КПТ) и внутрикожные тесты (ВТД) с гидроксизином и прометазином.КПТ были отрицательными, а ИДТ – положительными для обоих препаратов в разведении 1/10 (5 мг/мл и 2,5 мг/мл соответственно). Патч-тесты с оксатомидом были отрицательными. Одинарная слепая плацебо-контролируемая пероральная провокация (SBPCOC) с возрастающими дозами альтернативного антигистаминного препарата дезлоратадина (общая доза 10 мг) хорошо переносилась.

Пять месяцев спустя он вернулся в нашу клинику с круглым, четко ограниченным, фиолетовым, узловатым, не зудящим поражением на правой ноге (рис. 1), приблизительно через 18 часов после приема нимесулида (100 мг) и кларитромицина (500 мг). ), назначают при остром фарингите.Он прекратил прием обоих препаратов, но через 48 часов у него развилось серьезное везикуляционное поражение (рис. 2), которое разрешилось через 3 недели.

Рис. 1. Рецидивирующее поражение после приема препарата, предполагающее индуцированную нимесулидом фиксированную лекарственную сыпь.

Рис. 2. Везикулезное поражение.

Когда конкретно спросили о рецидиве поражения, пациент вспомнил, что у него также было преобладающее круглое поражение в поясничной области каждый раз, когда он принимал оксатомид, что он недооценил.

SPT и IDT с кларитромицином были отрицательными.

Биопсия кожи, выполненная через 2 недели после появления поражения, выявила гистологические данные, соответствующие эпидермальному некролизу (рис. 3).

Рис. 3. Биопсия кожи с подозрением на эпидермальный некролиз.

Патч-тесты (10 % у животных) на остаточной пигментированной коже, проведенные через 2 месяца после появления поражения, дали положительный результат (48 ч) на нимесулид (+ + +) (Aulin®, Donulide®) и парацетамол-кофеин- бромфенираминовая ассоциация (+) (Ilvico®) (рис. 4). Контрольные патч-тесты на непораженной коже были отрицательными.

Рис. 4. Положительный результат тестирования пластыря на остаточном поражении.

SBPCOC с увеличением дозы альтернативного НПВП, мелоксикама, до 15 мг, проводилась с хорошей переносимостью.

В настоящее время он сохраняет остаточную гиперпигментацию и избегает препаратов-виновников.

ОБСУЖДЕНИЕ

Как и в большинстве случаев, возбудитель был идентифицирован по анамнезу пациента, рецидиву поражения на ранее пораженном участке после повторного воздействия подозреваемого(ых) препарата(ов) и положительному тесту пластыря на остаточных поражениях 3,10.

Оральная провокационная проба с подозрением на наркотики не проводилась, учитывая, что у пациента была буллезная форма ФДЭ с риском развития генерализованной и тяжелой реакции. По мнению некоторых авторов, хотя повторная провокация остается наиболее надежным диагностическим методом, все чаще применяется местная провокация на участках предыдущих поражений, поскольку это простая, быстрая и безопасная альтернатива оральной провокации 10,11.

Положительный результат пластыря на ассоциацию парацетамол-кофеин-бромфенирамин можно объяснить тем фактом, что у этого пациента также была гиперчувствительность к антигистаминным препаратам.

Таким образом, то, что мы первоначально приняли за уртикарную реакцию на антигистаминный препарат, на самом деле могло быть ФДЭ, учитывая, что каждый раз, когда пациент принимал оксатомид, преобладало поражение в поясничной области. Пациент сообщил об этом преимущественном поясничном поражении только после того, как мы заподозрили, что поражение на его ноге было ФДЭ, и специально спросили его о рецидиве поражения.

КПТ и ИДТ с оксатомидом не проводились, так как в нашей стране нет доступных препаратов для парентерального введения.Аппликационные тесты с этим препаратом были отрицательными, вероятно, потому, что они проводились на здоровой коже. Больной отказался от пластыря с оксатомидом на остаточном очаге в поясничной области, так как у него уже был альтернативный антигистаминный препарат.

Нечастая сенсибилизация к нескольким лекарствам 12. Когда это происходит, поражения имеют предпочтительную локализацию, связанную с каждым из участвующих лекарств, повторяясь в одном конкретном месте каждый раз, когда принимается это лекарство 6.

Лечение заключается в отмене препарата.Поражения обычно исчезают в течение одной недели, но повышенная пигментация может сохраняться в течение нескольких месяцев. Как правило, лечение кортикостероидами не требуется. Однако при генерализованной буллезной форме заболевания могут потребоваться местные кортикостероиды, системные противомикробные препараты и антигистаминные препараты 3.

В заключение, похоже, что это буллезная форма ФДЭ, вызванная нимесулидом и, в конечном итоге, оксатомидом.

Мы считаем важным, чтобы врачи знали, что, несмотря на распространенность, ФДЭ часто диагностируется неправильно, и что ключом к подозрению на это состояние являются подробный анамнез и физикальное обследование.

Противовоспалительное лекарственное средство, нимесулид (4-нитро-2-феноксиметансульфоанилид), разъединяет митохондрии и индуцирует изменение митохондриальной проницаемости в клетках гепатомы человека: защита альбумином

Abstract

Как и другие нестероидные противовоспалительные препараты, нимесулид (4-нитро-2-феноксиметан-сульфоанилид) вызывает гепатит у некоторых реципиентов. Хотя было показано, что нимесулид разъединяет митохондриальное дыхание и вызывает некроз гепатоцитов в отсутствие альбумина, механизмы гибели клеток до конца не изучены, и сравнение с концентрациями у человека затруднено, поскольку 99% нимесулида связывается с альбумином.Мы изучили эффекты нимесулида с физиологической концентрацией альбумина или без нее в изолированных митохондриях или микросомах печени крысы и в клетках гепатомы человека. Нимесулид не подвергался моноэлектронному нитровосстановлению в микросомах. В митохондриях, инкубированных без альбумина, нимесулид (50 мкМ) снижал потенциал митохондриальной мембраны (ΔΨ

м ), усиливал базальное дыхание и потенцировал переход митохондриальной проницаемости (MPT), запускаемый предварительной нагрузкой кальция.В клетках HUH-7, инкубированных в течение 24 ч без альбумина, нимесулид (1 мМ) снижал ΔΨ m и клеточный NAD(P)H и увеличивал отношение глутатиондисульфид/восстановленный глутатион и клеточные пероксиды; нимесулид вызывал MPT, истощение АТФ, высокий уровень кальция в клетках и вызывал в основном некроз с редкими апоптозными клетками. Совместная инкубация либо с циклоспорином А (ингибитор МРТ), либо с комбинацией фруктозо-1,6-дифосфата (субстрат гликолиза) и олигомицина (ингибитор АТФазы) предотвращала снижение ΔΨ m , истощение АТФ и гибель клеток.Физиологическая концентрация альбумина устраняла эффекты нимесулида на изолированные митохондрии или клетки HUH-7. В заключение следует отметить, что слабая кислота, нимесулид, разобщает митохондрии и вызывает истощение MPT и АТФ в изолированных митохондриях или клетках гепатомы, инкубированных без альбумина. Однако в присутствии альбумина в клетки или органеллы проникает лишь часть препарата, разобщения и токсичности не наблюдается.

Сноски

  • Эта работа была частично поддержана грантом Helsinn Healthcare (Лугано, Швейцария) и Министерством национального образования, исследований и технологий (стипендия С.С.).

  • Статью, дату публикации и информацию о цитировании можно найти на http://jpet.aspetjournals.org.

  • doi:10.1124/jpet.106.104125.

  • СОКРАЩЕНИЯ: нимесулид, 4-нитро-2-феноксиметансульфоанилид; НПВП, нестероидный противовоспалительный препарат; ΔΨ м , митохондриальный мембранный потенциал; MPT, переход митохондриальной проницаемости; MOPS, 4-морфолинпропансульфоновая кислота; TES, N -трис(гидроксиметил)метил-2-аминоэтансульфокислота; ЭПР, электронный спиновой резонанс; ЛДГ, лактатдегидрогеназа; LY294002, 2-(4-морфолинил)-8-фенил-4H-1-бензопиран-4-он; PBS, фосфатно-солевой буфер; DiOC6, 3,3′-дигексилоксакарбоцианин; Fluo-3 AM, производное ацетоксиметилового эфира индикатора кальция, Fluo-3; DCFH-DA, диацетат дихлордигидрофлуоресцеина; DCF, дихлорфлуоресцеин; CHAPS, 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфоновая кислота; GSH, восстановленный глутатион; GSSG, дисульфид глутатиона; FCCP, карбонилцианид p -трифторметоксифенилгидразон; АФК, активные формы кислорода; MnSOD – супероксиддисмутаза марганца; F-1,6-dP, фруктозо-1,6-дифосфат; PI, йодид пропидия.

      • Получено 7 марта 2006 года.
      • Принято 11 апреля 2006 г.
  • Американское общество фармакологии и экспериментальной терапевты

гиалуроновые кислоты-нимесулидные конъюгаты в качестве противоопухолевых препаратов против CD44

вы-грехи Цзянь, 1 Чинг-Вэнь Чен, 1 Чжи-Ань Линь, 2 Сю-Пин Ю, 1 Хуа-Ян Линь, 3 Минг-Юань Ляо, 1 Шу- 1 Yan-Fu Lin, 1 Ping-Shan Lai 1,2,4,5

1 Факультет химии, 2 Докторская программа по тканевой инженерии и регенеративной медицине, Национальный университет Chung Hs Тайчжун, 3 Отдел доклинических исследований, Holy Stone Healthcare Co., Ltd., Taipei, 4 Исследовательский центр устойчивой энергетики и нанотехнологий, 5 Rong Hsing Research Center for Translation Medicine, National Chung Hsing University, Тайчжун, Тайвань

Резюме: Системы доставки лекарств, опосредованные носителями, перспективны терапевтические средства для направленной доставки и повышения эффективности и безопасности сильнодействующих цитотоксических препаратов. Нимесулид является многофакторным нестероидным противовоспалительным препаратом циклооксигеназы 2 с анальгетическими, жаропонижающими и мощными противоопухолевыми свойствами; однако низкая растворимость нимесулида ограничивает его применение.Лекарства, конъюгированные с гиалуроновой кислотой (ГК), являются инновационными системами доставки лекарств, опосредованными переносчиками, характеризующимися CD44-опосредованным эндоцитозом ГК и внутриклеточным высвобождением лекарств. В этом исследовании гидрофобный нимесулид был конъюгирован с ГК двух разных молекулярных масс (360 кДа в виде ГК с высокой молекулярной массой [HAH] и 43 кДа в виде ГК с низкой молекулярной массой [HAL]) для улучшения его способности воздействовать на опухоль и гидрофильности. Наши результаты показали, что гидрированный нимесулид (N-[4-амино-2-феноксифенил]метансульфонамид) успешно конъюгировался с обоими типами ГК путем карбодиимидного связывания, а степень замещения нимесулида составляла 1%, что характеризовалось 1 ядер H. магнитно-резонансная 400 МГц и полная корреляционная спектроскопия.Как Alexa Fluor ® 647, меченый HAH, так и HAL, могут избирательно накапливаться в области колоректальной опухоли со сверхэкспрессией CD44 HT-29 in vivo, что наблюдается с помощью системы визуализации in vivo. В тесте на цитотоксичность in vitro конъюгат ГК-нимесулид продемонстрировал >46% способность к гибели клеток при концентрации нимесулида 400 мкМ в клетках HT-29, тогда как незначительные цитотоксические эффекты наблюдались на клетках HCT-15, что указывает на то, что ГК-нимесулид вызывает клеточную гибель клеток HT-29 со сверхэкспрессией CD44. Что касается противоопухолевого исследования in vivo, как HAL-нимесулид, так и HAH-нимесулид вызывали быстрое сокращение опухоли в течение 3 дней и успешно ингибировали рост опухоли, который достиг 82.3% и 76,4% на 24-й день за счет апоптотического механизма у мышей с ксенотрансплантатом HT-29 без заметных морфологических различий в печени или почках соответственно. Эти результаты показали, что ГК-нимесулид с улучшенной селективностью за счет взаимодействия рецепторов HA/CD44 может повысить терапевтическую эффективность и безопасность нимесулида для лечения рака.

Введение

Колоректальный рак (КРР) со скрытым началом, низкой частотой ранней диагностики и неблагоприятным долгосрочным прогнозом является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований в промышленно развитых странах, а смертность от КРР в основном связана с метастатическим раком в печени или легких.Текущее лечение пациентов с CRC представляет собой первичную хирургическую резекцию без химиотерапии или с химиотерапией с использованием обычных химиотерапевтических агентов, таких как 5-фторурацил (5-FU), иринотекан и оксалиплатин. 1–3 Однако химиорезистентность широко наблюдалась и была признана ключевой причиной неудачи химиотерапии КРР. 4,5 Поэтому в последнее время внимание исследователей привлекает разработка новых стратегий лечения КРР.

CD44 представляет собой многофункциональный рецептор клеточной поверхности, который участвует во многих клеточных процессах, включая рост, выживание, дифференцировку и подвижность. 6–9 Этот рецептор также играет важную роль в миграции раковых клеток и адгезии матрикса в клеточном микроокружении, тем самым усиливая клеточную агрегацию и рост опухоли. 10,11 В последнее время выраженная экспрессия CD44 рассматривалась как отличительная черта высокоонкогенных клеток CRC 12 и как компонент сигнатуры гена стволовых клеток рака кишечника, который предсказывает рецидив заболевания у пациентов с CRC. 13 Эта сигнатура специфически связана с клетками CRC, наделенными высоким потенциалом инициации опухоли, а также способностью к длительному самообновлению.Следовательно, CD44 представляет собой потенциальную терапевтическую мишень для лечения CRC. 14–16

Гиалуроновая кислота (ГК), которая состоит из дисахаридных повторов D -глюкуроновой кислоты и N -ацетил- D -глюкозамина, представляет собой линейный полисахарид, который специфически связывается с рецепторами клеточной поверхности, такими как CD44, RHAMM. и ICAM-1 для активации широкого спектра внутриклеточных сигналов и регулирования различных клеточных процессов, включая морфогенез, заживление ран, воспаление и патологические состояния. 17–19 Кроме того, благодаря превосходной гидрофильности, высокой биосовместимости, нетоксичности и не раздражающим свойствам, ГК является подходящим природным материалом для биомедицинских применений, таких как косметика, 20 клеточная терапия, 21 тканевая инженерия 22 и Доставка наркотиков. 23–25 Одним из преимуществ использования конъюгации ГК является то, что она улучшает растворимость в воде гидрофобных препаратов, таких как паклитаксел и куркумин 26–28 , и обеспечивает возможность нацеливания системы доставки лекарств.ГК различной молекулярной массы выполняет различные функции в организме. ГК с высокой молекулярной массой (1000 кДа) играет важную физиологическую роль в живых организмах, включая поддержание вязкоупругости жидких соединительных тканей и организацию протеогликанов во внеклеточном матриксе. Предполагается, что ГК с низкой молярной массой индуцирует рецептор-опосредованную внутриклеточную передачу сигналов, тем самым действуя как эндогенный сигнал для активации Т-клеток и индуцируя процессы воспаления и ангиогенеза. 29–31

Воспаление увеличивает развитие предраковых поражений в различных анатомических областях. Например, у пациентов, которые ранее страдали простатитом 32 , отмечается повышение риска развития рака предстательной железы на 13,6%, а также сообщалось о повышении риска колоректального рака на 25% из-за язвенного колита. 33 Нимесулид, селективный ингибитор циклооксигеназы 2, представляет собой препарат с противовоспалительными, обезболивающими, жаропонижающими свойствами 34,35 и химиопрофилактическим действием в отношении канцерогенеза мочевого пузыря, толстой кишки, печени и молочной железы. 36–38 Сообщалось, что нимесулид индуцирует клеточный апоптоз и ингибирует рост опухоли при различных типах рака в исследованиях как in vitro, так и in vivo; 39–43 однако плохая растворимость нимесулида в воде ограничивает его биомедицинское применение. 44,45 Общие лекарственные формы нимесулида представляют собой таблетки или капсулы для противовоспалительного лечения. 46 Недавно была разработана инъекционная форма нимесулида с этаноламином, L -цистеином, этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и молочной кислотой. 47 О новых препаратах нимесулида для внутривенных инъекций почти не сообщалось. В этом исследовании нимесулид конъюгировали с ГК для улучшения его растворимости в воде и селективности в отношении опухолей, а противоопухолевую эффективность конъюгатов ГК-нимесулид с двумя различными молекулярными массами оценивали in vitro и in vivo.

Материалы и методы

Материалы

HA (HA с высокой молекулярной массой [HAH] 360 кДа и HA с низкой молекулярной массой [HAL] 43 кДа; Freda Biopharm) получали от HolyStone (Тайбэй, Тайвань).Нимесулид, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (EDC) гидрохлорид, N -гидроксисукцинимид (NHS), этил (гидроксиимино)цианоацетат (Oxyma), флуоресцеинизотиоцианат (FITC) изомер I, дигидразид адипиновой кислоты ( ADH), раствор пенициллин-стрептомицин-неомицин (PSN) и 10% формалин были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид и Pd/C (5%) были получены от ACROS (Нью-Джерси, США). Для исследований клеточных культур использовали модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM), DMEM: питательную смесь F-12 (DMEM/F12), 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (MTT), эмбриональная бычья сыворотка (ФБС) и 0.25% трипсин-ЭДТА были приобретены у Thermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США). Alexa Fluor ® 647 кадаверин был приобретен у Thermo Fisher Scientific.

Синтез N -(4-амино-2-феноксифенил)метансульфонамида (NiNH 2 )

Для синтеза NiNH 2 для дальнейшей конъюгации ГК раствор 0,5 г нимесулида (NiNO 2 ) в 20 мл этилацетата гидрировали при комнатной температуре и атмосферном давлении в присутствии О.2 г Pd/C (5%) в течение 24 ч (рис. 1). Реакцию контролировали с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем и визуализировали в ультрафиолетовом свете. После завершения реакции катализатор отфильтровывали, фильтрат осаждали в избытке этилового эфира и упаривали в вакууме с получением порошка NiNH 2 . Продукт был подтвержден анализом 1 H ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 400 МГц с использованием следующих параметров: 1 H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6; δH 2.85 [с, 3H, CH 3 ], 5,24 [дейтерийобменный с, 2H, NH 2 ], 6,01 [д, 1H, J=3 Гц], 6,2–6,3 [дд, 1H, J=3 Гц , 6 Гц], 6,9–7,2 [м, 4H], 7,3–7,5 [м, 2H], 8,73 [дейтерообменный с, 1H, NH]). 48,49

Рис. 1 Схематическая иллюстрация синтеза конъюгатов ( A ) NiNH 2 и ( B ) ГК–нимесулид.
Сокращения: ЭА, этилацетат; EDC, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид; ГК, гиалуроновая кислота; ч, часы; NHS, N -гидроксисукцинимид; NiNH 2 , N -(4-амино-2-феноксифенил)метансульфонамид.

Синтез нимесулида, конъюгированного с ГК

Для синтеза ГАГ-нимесулида 1 г ГАГ сначала растворяли в 500,0 мл воды и реагировали с 20,0 мл водного раствора EDC/NHS (502 мг EDC и 302 мг NHS) в течение 5 минут. Затем к активированному раствору ГАУ добавляли 72 мг порошка NiNH 2 , растворенного в 1 мл ДМСО, и оставляли реагировать на 12 ч при комнатной температуре. Полученный раствор подвергали диализу с использованием диализного мешка с отсечением по молекулярной массе (MWCO) 3500 против большого избытка 0.3 М раствор NaCl и вода в течение 4 дней. Для синтеза HAL-нимесулид 700 мг HAL сначала растворяли в смеси растворов, содержащей 140,0 мл воды и 70,0 мл ДМСО, и подвергали реакции с 14,0 мл раствора EDC/NHS (351 мг EDC и 211 мг NHS). ) на 5 минут. Затем к активированному раствору ГАЛ добавляли 100,8 мг NiNH 2 , растворенного в 7,0 мл ДМСО. После перемешивания в течение 12 ч полученный раствор подвергали диализу с использованием диализного мешка MWCO 3500 в течение 5 сут, лиофилизировали и затем хранили при 4°С для дальнейших исследований.Строение образца и степень замещения (СЗ) ГК нимесулид, определяемую как число молекул нимесулида, приходящееся на одну молекулу ГК, оценивали методом ЯМР 1 Н 400 МГц. 50,51

Синтез ГК, меченной флуоресцентным красителем

FITC-меченый HAH (HAH-ADH-FITC) получали путем химической конъюгации FITC с аминогруппой HA-ADH посредством образования тиомочевины. Сначала 50 мг НАГ растворяли в 12,5 мл воды и к раствору НАГ добавляли 114,8 мг АДГ.Затем рН реакционной смеси доводили до 4,75 добавлением 0,1 н. HCl (водн.) и к этой смеси добавляли 25,1 мг ЭДХ для активации карбоксильной группы ГК. Через 15 минут реакцию гасили добавлением 0,1 н. NaOH (водн.) , затем полученный раствор переносили в предварительно обработанную диализную трубку (MWCO 3500) и тщательно диализовали против 0,3 М NaCl (водн.) и воды в течение 4 часов. дней. Полученный раствор лиофилизировали и хранили при 4°С.DS ADH в HAH-ADH измеряли с помощью 1 H ЯМР 400 МГц. 52,53 Для синтеза HAH-ADH-FITC, HAH-ADH (88 мг) сначала растворяли в 35 мл воды, смешивали с раствором FITC (9,5 мг FITC, растворенных в 10 мл ДМСО) в течение 48 ч при комнатной температуре, затем смесь подвергали диализу против 0,3 М NaCl (водн.) и чистой воды попеременно с использованием диализного мешка MWCO 12000–14000. Полученный раствор лиофилизировали, анализировали на флуоресцентном спектрометре (FP-6300; Jasco, Япония) и затем хранили при 4°C до использования.

краситель NIR (Alexa Fluor 647 кадаверин), меченый HAH (краситель HAH-NIR), и краситель HAL-NIR были синтезированы путем активации карбоксильной группы HA. Сначала 40 мг HAH или HAL и 11 мг Oxyma растворяли в 4 мл воды. Затем к раствору ГК добавляли 2 мл диметилформамида. Во-вторых, в раствор смеси добавляли 32 мкл ДИК. После перемешивания в течение 5 минут к активированному раствору ГК добавляли 0,2 мг БИК-красителя, растворенного в 100 мкл воды, и оставляли реагировать на 24 часа при комнатной температуре.Затем раствор добавляли к 32 мкл ДИК и оставляли реагировать на 24 часа. Полученный раствор подвергали диализу с использованием диализного мешка MWCO 3500 в течение 5 дней, лиофилизировали, анализировали с помощью флуоресцентного спектрометра (FP-6300; Jasco) и затем перед использованием хранили при 4°C.

ГПХ-анализ конъюгатов ГК-нимесулид

Молекулярно-массовое распределение ГК и водного раствора ГК-нимесулид оценивали с помощью системы ГПХ, состоящей из контроллера насоса Waters 600 (Waters, Милфорд, Массачусетс, США), инъекционного клапана с петлей для проб объемом 200 мкл, ультрагидрогеля 2000 и 250 столбцы 7.8×300 мм (Уотерс), детектор с показателем преломления 2414 (Уотерс) и фотодиодная матрица (настройка на 254 нм, ~λ макс. нимесулида; Уотерс), с использованием подвижной фазы 0,02 М NH 4 H 2 PO 4(водн.) и 0,3 М NaNO 3(водн.) при 40°C со скоростью потока 0,7 мл/мин.

Анализ клеточной культуры и проточной цитометрии

клетки CRC человека HT-29 и HCT-15 были приобретены в Американской коллекции типовых культур. Клетки CRC человека HT-29 или HCT-15 выращивали в колбах T75 с использованием культуральной среды DMEM или DEMM/F12 с добавлением 10% (об./об.) FBS и 1% раствора PSN соответственно.Клетки выдерживали во влажном инкубаторе при 37°С в 5% СО 2 и субкультивировали два-три раза в неделю с использованием 0,25% трипсина. Чтобы оценить экспрессию рецептора CD44 в HT-29 или HCT-15, клетки один раз промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем собирали с 0,25% трипсином-ЭДТА. Отслоившиеся клетки промывали PBS, содержащим 1% FBS и 1% пенициллин/стрептомицин (промывочный буфер), и ресуспендировали в промывочном буфере (1×10 6 клеток/мл). Антитела к CD44, конъюгированные с FITC (CD44-FITC; eBioscience), добавляли в разведении 1:200 и инкубировали в темноте на льду в течение 30 минут.Меченые клетки промывали в PBS, фиксировали в PBS, содержащем 4% параформальдегида, и анализировали на Accuri™ C6 (цитометры BD Accuri; BD Biosciences, Анн-Арбор, Мичиган, США). Количество клеточного поглощения HAH-ADH-FITC клетками HT-29 и HCT-15 оценивали с помощью проточной цитометрии. Вкратце, клетки HT-29 или HCT-15 (1×10 6 клеток/лунку) высевали в шестилуночный планшет на 24 часа. HAH-ADH-FITC (FITC: 1 мкМ; HA-краситель: 1 мг/мл) добавляли к клеткам в течение различных периодов времени инкубации, соответственно. Клетки один раз промывали PBS, а затем собирали 0.25% трипсин-ЭДТА. Отслоившиеся клетки ресуспендировали в культуральной среде. Затем клетки анализировали с помощью Accuri C 6 (цитометры BD Accuri) с использованием FL1 (533/30 нм). Для анализа апоптоза клетки, обработанные H 2 O 2 в концентрации 10 мМ или HAL-нимесулид в концентрации 200 мкМ нимесулида в течение 48 ч, собирали путем трипсинизации, промывали PBS и ресуспендировали в связывающем буфере (200 мкл), содержащем аннексин V. -FITC (20 мкг/мл) и йодид пропидия (20 мкг/мл) в течение 30 минут при комнатной температуре.Затем клетки анализировали с помощью Accuri C6 (цитометры BD Accuri) с использованием FL1 (533/30 нм) и FL3 (610/20 нм).

Анализ цитотоксичности

Для оценки цитотоксичности свободного нимесулида, модифицированного нимесулида NiNH 2 , конъюгатов HAH-нимесулид и HAL-нимесулид на клетках HT-29 и HCT-15 клетки высевали в 96-луночный планшет в количестве 1×10 4 клеток/лунку со средой, дополненной 10% FBS и 1% раствором PSN, и культивировали в течение 24 ч до эксперимента.Затем клетки обрабатывали средой, смешанной с двукратными серийными разведениями нимесулида или эквивалентной концентрацией нимесулида в диапазоне от 400 до 3,125 мкМ. Клетки, обработанные HAH или HAL, использовали в качестве контрольной группы. Через 48 ч клетки трижды промывали PBS и инкубировали в свежей среде, содержащей МТТ, в темноте еще 3 ч. После удаления среды в каждую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО при непрерывном встряхивании в течение 30 мин. Результаты считывали с помощью сканирующего многолуночного планшет-ридера при 570 нм (SpectraMax ® M2e; Molecular Devices LLC, Саннивейл, Калифорния, США).

In vitro и in vivo флуоресцентная визуализация HA-красителя

Для оценки клеточного поглощения и аффинности связывания HAH-ADH-FITC в различных клеточных линиях клетки HT-29 или HCT-15 (5×10 4 клеток/лунку) высевали на покровные стекла на 24 часа. CD44-FITC или HAH-ADH-FITC (FITC: 1 мкМ; HA-краситель: 1 мг/мл) добавляли к клеткам в течение различных периодов инкубации соответственно. Группы, получавшие CD44-FITC, служили в качестве положительного контроля. К клеткам добавляли раствор Hoechst 33342 и инкубировали в течение 10 минут.После окрашивания клетки трижды промывали 1× PBS, помещали на предметные стекла и исследовали сигналы флуоресценции с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии при возбуждении 488 нм и эмиссии 500–600 нм (Leica-SP5; Leica Microsystems). , Heidelberg GmbH, Германия).

Эксперименты с неинвазивной системой визуализации in vivo (IVIS) были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Национального университета Chung Hsing, Тайвань, Китайская республика (разрешение IACUC № 104-020) на основании Руководства по уходу и использованию животных. Лабораторные животные. 54 Клеточная линия HT-29 с высоким уровнем экспрессии CD44 использовалась для создания животной модели опухоли. Вкратце, самкам бестимусных мышей nu/nu (голых) (в возрасте 5–6 недель, BioLASCO, Тайвань, Китайская республика) стерильно и подкожно вводили 2×10 7 клеток HT-29 в правый бок. Раствор красителя HAH-NIR (краситель HAH-NIR: 20 мг/мл, 200 мг/кг) и раствор красителя HAL-NIR (краситель HAL-NIR: 20 мг/мл, 200 мг/кг) вводили внутривенно через хвостовую вену. когда опухоли достигли объема примерно 500–600 мм 3 .Изображения записывали с помощью системы штангенциркуля IVIS (фильтр возбуждения: 640 нм, фильтр излучения: 680 нм, время экспозиции: 1 с, f/stop: 8) в моменты времени 1, 4, 8, 24 и 48 ч после инъекции. В последний момент времени мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков. Флуоресцентные изображения опухолей, сердца, печени, селезенки, почек, головного мозга и мышц также анализировали с помощью системы визуализации IVIS (IVIS ® Spectrum CT; PerkinElmer Inc., Уолтем, Массачусетс, США). Флуоресцентные изображения были количественно оценены с помощью программного обеспечения Living Image (PerkinElmer Inc.).

Противоопухолевые эффекты конъюгатов ГК-нимесулид

Противоопухолевые экспериментальные протоколы in vivo были одобрены IACUC Национального университета Chung Hsing, Тайвань, Китайская республика (разрешение IACUC № 104-020) на основании Руководства по уходу и использованию лабораторных животных. 54 Самки голых мышей BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl (возраст 5–6 недель, 20±2 г) были получены из Национального центра лабораторных животных (Тайвань). Все мыши содержались в кондиционируемом помещении с искусственным циклом свет-темнота, получали стандартную пищу и фильтрованную воду.Мышей акклиматизировали к этой среде в течение по меньшей мере 3 дней перед подкожной инъекцией в правую заднюю часть 2×10 7 клеток НТ-29, суспендированных в среде. Размер опухоли и массу тела измеряли каждые 3 или 4 дня на протяжении всего эксперимента. Объем опухоли рассчитывали как 1/2(4π/3)(L/2)(W/2)H, где L — длина, W — ширина, а H — высота опухоли. Лечение начинали, когда опухоли достигали объема приблизительно 100 мм 3 (день 0).Мышей рандомизировали в шесть лечебных групп (n=4 на группу). Животным три раза в неделю вводили PBS (контрольная группа), нимесулид или ГК-нимесулид в эквивалентной концентрации нимесулида 1,5 мг/кг. Мыши, получавшие 50 мг/кг 5-ФУ один раз в неделю через латеральную хвостовую вену, выступали в качестве группы положительного контроля. 55,56 Размер опухоли и массу тела регистрировали для каждой мыши каждые 3 или 4 дня. Процент ингибирования роста опухоли (TGI%) рассчитывали по относительному объему опухоли на 24-й день.

Вскрытие и анализ терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP с мечением концов срезов опухоли

Опухоли вырезали и взвешивали после умерщвления мышей. Перед иммуногистохимическим и окрашиванием гематоксилином и эозином ткань опухоли фиксировали в формалине и заливали в парафин. Апоптоз клеток анализировали с помощью анализа концевой маркировки dUTP терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TUNEL) с использованием набора Click-iT ® TUNEL Alexa Fluor Imaging Assay Kit (Thermo Fisher Scientific), и экспериментальная процедура выполнялась в соответствии с инструкциями производителя.Вкратце, срезы опухолей мышей толщиной 2 мкм в каждой группе лечения погружали в 0,25% раствор Triton ® X-100 PBS. После промывки PBS срезы окрашивали реакционной смесью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы в течение 90 минут при 37°C и промывали PBS. Затем реакционный коктейль Click-iT и Hoechst 33342 использовали для окрашивания срезов в темноте для мечения апоптотических клеток и клеточной ДНК. После окрашивания флуоресценцию Hoechst 33342 и Alexa Fluor ® 488 наблюдали с помощью конфокальной микроскопии Leica SP5 с возбуждением 405 или 488 нм соответственно.

Результаты и обсуждение

Характеристика NiNH 2 и ГК-нимесулида

NiNH 2 был синтезирован гидрированием нимесулида. Как показано на рисунке 2, пик аминогруппы NiNH 2 был идентифицирован при 5,24 м.д., что указывает на успешный синтез NiNH 2 , который может далее конъюгировать с ГК. На рис. 3 представлены спектры ЯМР 1 H HAH-нимесулида и HAL-нимесулида, где сильный ацетильный (-NHCOCH 3 ) пик HA идентифицируется при 2.0 м.д., а пики ароматических протонов нимесулида находятся в диапазоне 7,6–6,8 м.д. DS нимесулида в синтезированных конъюгатах ГК-нимесулид, которую определяют как отношение нимесулида на 100 единиц ГК, рассчитывали из коэффициента интегрирования характеристических пиков ГК при 2,0 м.д. и нимесулида при 7,6-6,8 м.д. DS ГК-нимесулида, определяемая как количество молекул нимесулида на молекулу ГК, составляла 1% по данным 1 H ЯМР 400 МГц. Чтобы дополнительно уточнить сохранение структуры нимесулида после процесса конъюгации, мы использовали полную корреляционную спектроскопию (TOCSY) для определения каждого сигнала нимесулида после конъюгации ГК.Как показано на рисунке 4, результаты TOCSY ясно показали наличие двух спиновых систем. Первая спиновая система содержала протоны при 7,05 м.д. (Ar’-2H, Ar’-6H), 7,18 м.д. (Ar’-4H) и 7,39 м.д. (Ar’-3H, Ar’-5H), а вторая спиновая система содержала протонов при 6,97 м.д. (Ar-6H) и 7,33 м.д. (Ar-5H), что указывает на то, что нимесулид успешно конъюгировался с HA. Эти результаты обобщены в таблице 1.

Рисунок 2
Сокращения: NiNH 2 , N -(4-амино-2-феноксифенил)метансульфонамид; ЯМР, ядерно-магнитный резонанс.

D ) свободный HAH.
Сокращения: NiNH 2 , N -(4-амино-2-феноксифенил)метансульфонамид; ЯМР, ядерный магнитный резонанс; ГК, гиалуроновая кислота; HAH, HA с высокой молекулярной массой; HAL, HA с низкой молекулярной массой.

Рисунок 4. Результаты TOCSY (жирная линия) для конъюгата ГК-нимесулид.
Сокращения: ГК, гиалуроновая кислота; TOCSY, полная корреляционная спектроскопия.

Таблица 1 1 H ЯМР спектроскопия ароматического кольца нимесулида в конъюгате ГК–нимесулид
Сокращения: ГК, гиалуроновая кислота; ЯМР, ядерно-магнитный резонанс.

Молекулярно-массовое распределение ГК и ГК-нимесулида измеряли с помощью ГПХ (рис. S1). HAH-нимесулид показал такое же время удерживания, как и исходный HA с использованием детектора RI, что указывает на отсутствие явных изменений в молекулярно-массовом распределении HA после конъюгации нимесулида.

Существует несколько стратегий конъюгации гидрофобного лекарственного средства с ГК. Например, HA, модифицированный ADH, может успешно конъюгировать с гемисукцинатом NHS, активированным сложным эфиром паклитаксела. 52 4-броммасляный паклитаксел можно конъюгировать с активированной карбодиимидом ГК путем образования сложноэфирной связи в органическом растворителе. 57 В этом исследовании нимесулид был конъюгирован с ГК с использованием связующего агента EDC/NHS в водном растворе. После конъюгации ГК ограничение нимесулида, то есть его плохая растворимость в воде (10,9 мкг/мл), 45 значительно улучшилось до >600 мкг/мл. Низкая степень замещения нимесулида наблюдалась в реакции между гидрофобным нимесулидом и гидрофильной ГК в водной фазе.Этот результат может быть связан с тем, что аминогруппа NiNH 2 является слабым нуклеофилом в реакции сочетания.

Экспрессия рецептора CD44 и аффинность связывания HA-ADH-FITC в клетках HT-29 и HCT-15

Уровень экспрессии CD44 в клетках HT-29 и HCT-15 сначала оценивали с помощью проточной цитометрии. Как показано на фигуре 5A, положительные количественные уровни флуоресценции экспрессии CD44 в клетках HT-29 и HCT-15 составляли 62,5% и 18,4% соответственно. Таким образом, считалось, что HT-29 демонстрирует высокий уровень экспрессии рецептора CD44, тогда как HCT-15 демонстрирует низкий уровень экспрессии рецептора CD44.Эти феномены экспрессии также определяли с помощью конфокальной микроскопии. Как показано на фигуре 5B, антитело CD44, конъюгированное с FITC, четко наблюдалось на поверхности клеток HT-29 через 3 часа. Однако в то же время в клетках HCT-15 не было обнаружено явного сигнала флуоресценции, что согласуется с результатами экспрессии CD44, определенными с помощью проточной цитометрии (фиг. 5А). Селективность FITC-меченого HA на клетках HT-29 и HCT-15 также оценивали с помощью конфокальной микроскопии. Как показано на рисунках 5C и D, сигнал флуоресценции HAH-ADH-FITC значительно наблюдался в клетках HT-29 через 6 часов, тогда как только несколько зеленых точек наблюдались через 24 часа в обработанных HAH-ADH-FITC клетках HCT- 15 клеток, что указывает на селективность HAH-ADH-FITC в отношении повышенной экспрессии рецептора CD44 в клетках HT-29 и интернализации по пути лиганд-рецептор. 58 Клеточное поглощение HAH-ADH-FITC в клетках HT-29 и HCT-15 также анализировали с помощью проточной цитометрии. Результаты показали, что экспрессия клеток FITC + в HT-29 и HCT-15 составила 66,8% и 36,3% (рис. S2) после 3 ч инкубации соответственно. Через 6 и 24 ч инкубации экспрессия клеток FITC + в НТ-29 и НСТ-15 увеличивалась до 73,4 и 50,6 % соответственно. Средняя интенсивность флуоресценции в группах HT-29, обработанных HAH-ADH-FITC, была выше, чем в группах HCT-15, что указывает на большее поглощение HAH-ADH-FITC в клетках HT-29.

Рисунок 5 ( A ) Анализ экспрессии CD44 в клетках HT-29 и HCT-15 методом проточной цитометрии; ( B ) иммуноцитохимия экспрессии CD44 в клетках HT-29 или HCT-15, оцененная с помощью конфокальной микроскопии при концентрации 1 мкМ CD44-FITC или 1 мг/мл HA-красителя. Внутриклеточное распределение HAH-ADH-FITC через 3, 6 и 24 часа после обработки в клетках ( C ) HT-29 и ( D ) HCT-15. Hoechst 33342 (показан синим цветом) используется для мечения ядер.CD44-FITC или HAH-ADH-FITC показаны зеленым цветом. Масштабная линейка: 10 мкм.
Сокращения: ADH, дигидразид адипиновой кислоты; FITC, изотиоцианат флуоресцеина; ГК, гиалуроновая кислота; HAH, HA с высокой молекулярной массой.

Неинвазивная визуализация IVIS красителя HA-NIR у мышей с подкожной колоректальной опухолью HT-29

Для оценки накопления в опухоли ГК, меченной красителем NIR, с различной молекулярной массой in vivo краситель HAH-NIR или краситель HAL-NIR вводили мышам внутривенно, и сигналы флуоресценции красителя NIR контролировали с помощью IVIS.Очевидно, что у мышей, которым вводили HAH-NIR или HAL-NIR, обнаруживались явные сигналы флуоресценции от 1 до 48 ч после инъекции, тогда как наблюдалось быстрое устранение свободного красителя NIR (рис. 6А). Этот результат указывает на то, что HAH-NIR или HAL-NIR быстро распределяются по всему телу во время циркуляции после инъекции. Для дальнейшего исследования накопления HAH-NIR или HAL-NIR в опухоли была проанализирована интенсивность флуоресценции области опухоли, наблюдаемая на фигуре 6A, и количественный результат был показан на фигуре 6B. С увеличением времени было обнаружено значительное увеличение интенсивности флуоресценции HAH-NIR в области опухоли.Интенсивность флуоресценции увеличилась в три раза через 48 ч после инъекции по сравнению с таковой через 1 ч после инъекции. Интересно, что интенсивность флуоресценции в области опухоли в группе HAL-NIR достигла плато через 8 часов после внутривенной инъекции. По сравнению с результатами группы HAL-NIR, HAH-NIR показал меньшее накопление опухоли через 1 час после инъекции, что может быть связано с более низкой на 34% интенсивностью флуоресценции HAH-NIR при исходной концентрации HA-NIR 20 мг/мл. (Рисунок 6С).

Рисунок 6 Флуоресцентная визуализация in vivo красителя HA-NIR с различной молекулярной массой HA.
Примечания: ( A ) Зависимое от времени распределение HA-NIR измеряли с помощью системы визуализации IVIS Xenogen после внутривенного введения красителя HA-NIR (краситель HA-NIR: 20 мг/мл, 200 мг/кг). ( B ) Количественная оценка сигнала флуоресценции на участке опухоли (n=3). ( C ) Спектры флуоресценции HAH-NIR, HAL-NIR и красителя. ( D ) Флуоресцентные изображения каждого органа и ( E ) количественная оценка флуоресценции изображений опухолей мышей, получавших HAL-NIR, HAH-NIR или свободный краситель через 48 часов после инъекции (n = 3).
Сокращения: ГК, гиалуроновая кислота; HAH, HA с высокой молекулярной массой; HAL, HA с низкой молекулярной массой; IVIS, система визуализации in vivo; мин, минимум, максимум, максимум; ROI, область интереса.

Поглощение HAH-NIR или HAL-NIR в различных органах определяли у мышей через 48 часов после инъекции, и результаты показаны на рисунке 6D. Очевидно, что в печени наблюдалось значительно более высокое накопление ГК, меченной красителем NIR, что отвечает за элиминацию ГК из кровотока. 59,60 Кроме того, было обнаружено, что HA-NIR накапливается в области опухоли, что свидетельствует об активной нацеливающей способности HA в опухолях со сверхэкспрессией рецептора CD44. 61,62 HA-NIR также обнаружен в селезенке и сердце. Для дальнейшего изучения различий в накоплении опухоли между HAH-NIR и HAL-NIR через 48 ч после инъекции интенсивность флуоресценции изолированной опухоли (рис. 6D) была проанализирована с помощью программного обеспечения Living Image. Как показано на рисунке 6E, количественная оценка сигналов флуоресценции изолированной опухоли выявила в два раза более высокую интенсивность флуоресценции HAH-NIR, чем у группы HAL-NIR, что указывает на более высокое накопление HA с высокой молекулярной массой в CD44-сверхэкспрессирующих HT-29 опухолях. .

Ингибирование роста клеток с помощью ГК-нимесулида

Жизнеспособность клеток в присутствии NiNO 2 (нимесулид), NiNH 2 (модифицированный нимесулид), ГК–нимесулид и ГК оценивали методом МТТ в клетках НТ-29 и НСТ-15. Как показано на Фигуре 7А, IC 50 свободного нимесулида составляла приблизительно 1600 мкМ в клетках HT-29 и HCT-15; однако выживаемость клеток в группах, обработанных NiNH 2 , составляла> 78% как в клетках HT-29, так и в клетках HCT-15 при 1600 мкМ. После добавления к клеткам ГК и инкубации в течение 48 ч цитотоксичность ГК в клетках НТ-29 и клетках НСТ-15 несколько увеличивалась.Как показано на рисунке 7B, конъюгат HAL-нимесулид проявлял способность к уничтожению клеток 42,4%, тогда как HAH-нимесулид давал выживаемость 52,9% при эквивалентной концентрации нимесулида (400 мкМ) в клетках HT-29. Незначительные цитотоксические эффекты наблюдались на клетках HCT-15, что указывает на то, что HA-нимесулид вызывает гибель клеток в клетках HT-29, экспрессирующих CD44 с высоким уровнем (рис. 7C).

Рисунок 7 ( A ) Оценка жизнеспособности клеток NiNH 2 и NiNO 2 (нимесулид) в клетках HT-29 и HCT-15.( B ) Жизнеспособность клеток HT-29 в HAL-нимесулид-1% или HAH-нимесулид-1% в течение 48 ч и ( C ) жизнеспособность клеток HT-29 и HCT-15, обработанных HAH-нимесулидом -1% на 48 ч.
Сокращения: NiNH 2 , N -(4-амино-2-феноксифенил)метансульфонамид; ГК, гиалуроновая кислота; HAH, HA с высокой молекулярной массой; HAL, HA с низкой молекулярной массой.

NiNH 2 является одним из основных метаболитов нимесулида, 63 , а нитрогруппа нимесулида может быть полностью восстановлена ​​до аминогруппы посредством катализа Р450 и/или редуктазы. 64 Ранее наблюдалась токсичность нимесулида по отношению к гепатоцитам 65,66 , что объясняется в основном нитрогруппой в его структуре. 67 После восстановления NiNH 2 проявляет меньшую токсичность, чем нимесулид, в гепатоцитах, поскольку нимесулид является мощным протонофоретическим разобщителем и окислителем НАД(Ф)Н. 67 Кроме того, NiNH 2 может полностью подавлять разобщающее и окислительное действие НАД(Ф)Н на митохондрии. 68,69 В этом исследовании нитрогруппа нимесулида сначала была восстановлена ​​до амина, а затем привита к ГК, что позволяет предположить, что ГК-нимесулид может снижать гепатотоксические эффекты свободного нимесулида.

Анализ апоптоза клеток HT-29, обработанных HA-нимесулидом

Для дальнейшего подтверждения роли запрограммированной гибели клеток, связанной с цитотоксическим эффектом HAL-нимесулида, был проведен анализ апоптоза с использованием двойного окрашивания аннексином-V/иодидом пропидия в клетках HT-29, обработанных HAL-нимесулидом. Как показано на фиг. 8A и B, суммарный процент клеточного апоптоза, включая поздний апоптоз (Q2) и ранний апоптоз (Q3), составил 81,1% (Q2 и Q3: 25,6% и 55,5% соответственно) в H 2 O 2 -обработанные клетки (группы положительного контроля), тогда как процент апоптоза клеток составлял 2.9% в группе отрицательного контроля (Q2 и Q3: 0,3% и 2,6% соответственно). При обработке HAL-нимесулидом при концентрации нимесулида 200 мкМ процент апоптотических клеток увеличился до 47,1% (Q2 и Q3: 4,6% и 42,5% соответственно), как показано на рисунке 8C. Интересно, что значительно более высокий процент раннего апоптоза наблюдался в клетках, обработанных HAL-нимесулидом (рис. 8C, Q3), по сравнению с клетками, обработанными H 2 O 2 (рис. 8B, Q3), что указывает на различные механизмы клеточный апоптоз.

Рисунок 8 Анализ апоптоза клеток HT-29 с использованием аннексина V-FITC и двойного окрашивания PI.
Примечания: ( A ) Группа отрицательного контроля; ( B ) клетки, обработанные H 2 O 2 при 10 мМ в качестве положительного контроля, и ( C ) клетки, обработанные HAL-нимесулидом при концентрации нимесулида 200 мкМ в течение 48 часов. Ось X представляет плотность аннексина V-FITC, тогда как ось Y представляет плотность PI.
Сокращения: FITC, изотиоцианат флуоресцеина; PI, йодид пропидия; ГК, гиалуроновая кислота; HAL, HA с низкой молекулярной массой.

В последние годы было показано, что нимесулид ингибирует рост раковых клеток и оказывает противоопухолевое действие на клетки гипофарингеальной карциномы, 41 опухоли легкого 70 и клетки аденокарциномы желудка. 40 Jia-Jun et al продемонстрировали, что нимесулид ингибирует пролиферацию клеток гипофарингеальной карциномы за счет ингибирования сурвивина и экспрессии каспазы-3, Bcl2 и Bax. 41 Li et al. обнаружили, что нимесулид индуцирует апоптоз клеток аденокарциномы желудка и остановку клеточного цикла за счет повышающей регуляции P27kip1. 40 В этом исследовании мы продемонстрировали, что ГК-нимесулид значительно индуцирует ранний апоптоз в колоректальных клетках HT-29, как сообщалось ранее, что приводит к активности по уничтожению клеток для дальнейшего лечения рака. Детальные механизмы остаются неясными, и соответствующие оценки продолжаются в нашей лаборатории.

HA-нимесулид ингибирует рост голых мышей с ксенотрансплантатами HT-29

Противоопухолевое действие конъюгатов HAL-нимесулид и HAH-нимесулид оценивали на модели ксенотрансплантированной опухоли HT-29.Все мыши с инъекцией опухоли имели одинаковый размер бедер в день 0. Доза нимесулида в свободном виде и нимесулида, конъюгированного с ГК, использованных в исследовании, составляла 1,5 мг/кг три раза в неделю; 50 мг/кг 5-ФУ вводили один раз в неделю путем внутривенной инъекции. На рисунке 9 показано уменьшение объема опухоли при применении HAL-нимесулида (TGI % =82,3% ± 5,0%) и HAH-нимесулида (TGI % =76,4% ± 6,9%) < 5-ФУ (TGI % = 70,7% ± 17,0%) < свободный нимесулид (TGI% = 55,9% ± 6,9%) по сравнению с необработанными контрольными животными. Противоопухолевые эффекты конъюгатов ГК-нимесулид могут быть связаны с высвобождением гликозилированного или олигосахаридного нимесулида из конъюгатов ГК-нимесулид после деградации ГК, поскольку мы наблюдали на ЯМР сигналы олигосахаридов нимесулида после обработки гиалуронидазой (данные не показаны).В нашей лаборатории продолжаются исследования механизмов ингибирования роста опухоли ГК-нимесулидом и подробной структуры гликозилированного или олигосахаридного нимесулида.

Рисунок 9 Противоопухолевые эффекты ГК-нимесулида in vivo у голых мышей с ксенотрансплантатами HT-29.
Примечания: Бестимусным мышам подкожно имплантировали клетки HT-29 и три раза в неделю обрабатывали 0,2 мл PBS, нимесулид (1,5 мг/кг), ГК-нимесулид (1.5 мг/кг эквивалентной концентрации нимесулида) или 5-ФУ (50 мг/кг) один раз в неделю. ( A ) Размер опухоли и ( B ) масса тела мышей после лечения лекарствами. ( C ) Морфология органов, масса опухоли и ( D ) TGI % после лечения лекарствами. Статистическую значимость определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Бонферрони, * P <0,05.
Сокращения: 5-ФУ, 5-фторурацил; ANOVA, дисперсионный анализ; ГК, гиалуроновая кислота; HAH, HA с высокой молекулярной массой; HAL, HA с низкой молекулярной массой; PBS, фосфатно-солевой буфер; TGI, ингибирование роста опухоли.

Исследование срезов тканей, окрашенных гематоксилином и эозином, выявило различия в морфологии тканей между группами лечения. Как показано на фиг. 10, в каждой группе не наблюдалось заметных морфологических различий в печени или почках. Важно отметить, что в области опухоли после инъекции ГК-нимесулида были обнаружены явления шелушения, тогда как клеточный митоз легко наблюдался в контрольной группе PBS и группе, получавшей нимесулид. Чтобы определить, индуцирует ли ГК-нимесулид гибель клеток посредством апоптоза опухолевых клеток, в анализе TUNEL была проанализирована частота апоптотических клеток в срезах опухоли HT-29, залитых парафином, из каждой группы.Как показано на рисунке 11, колокализация ядер (окрашивание Hoechst, показано красным) и TUNEL-позитивных апоптотических клеток (зеленый) в срезах опухоли была значительно увеличена в группе с HA-нимесулидом, тогда как в группе с HA-нимесулидом не наблюдалось значительной флуоресценции TUNEL. контрольная группа. В группе, получавшей нимесулид, наблюдалось несколько положительных клеток с зеленой флуоресценцией. Эти наблюдения дополнительно подтверждают результаты наших исследований цитотоксичности in vitro.

Рисунок 10 Гистологическая оценка печени, почек и опухоли после лечения PBS, 5-FU, нимесулидом или HA-нимесулидом у бестимусных мышей с ксенотрансплантатами HT-29 (400×).
Сокращения: 5-ФУ, 5-фторурацил; ГК, гиалуроновая кислота; PBS, фосфатно-солевой буфер.

Рисунок 11 Обнаружение разрывов цепей ДНК с помощью анализа TUNEL у голых мышей с ксенотрансплантатами HT-29, получавших PBS, нимесулид или HAH-нимесулид.
Сокращения: ГК, гиалуроновая кислота; HAH, HA с высокой молекулярной массой; PBS, фосфатно-солевой буфер; TUNEL, терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза dUTP с мечением концов.

Du et al. продемонстрировали, что клетки CD44 + , выделенные из CRC, обладают способностью к клональной экспансии и инициации ксенотрансплантата, но нокдаун CD44 в клетках значительно ингибирует инициацию и развитие опухоли у бестимусных мышей. 71 Клинические исследования показали, что у пациентов с CD44 + КРР сохраняется высокий риск рецидива. 72 Следовательно, было обнаружено, что экспрессия CD44 в CRC играет жизненно важную роль как в исследованиях in vivo, так и в клинических исследованиях.Сообщается, что пациенты с длительным воспалительным заболеванием кишечника имеют повышенный риск развития CRC. Готовые конъюгаты ГК-нимесулид могут потенциально действовать как противоопухолевые/воспалительные агенты для лечения опухоли CD44 + CRC и воспалительного заболевания кишечника. Недавно было продемонстрировано, что наночастицы на основе ГК или липосомальные наночастицы на основе ГК значительно продлевают время циркуляции крови, усиливают накопление CD44 + в области опухоли и улучшают терапевтическую эффективность доксорубицина in vivo. 73 В этом исследовании свежесинтезированный конъюгат ГК-нимесулид находился в форме гидрогеля, который можно было вводить мышам внутривенно, и он успешно ингибировал рост CD44-экспрессирующей опухоли HT-29 in vivo. Считается, что гидрогель конъюгата ГК-нимесулид обладает большим потенциалом для местного применения в других биомедицинских целях.

В последнее время внимание исследователей привлекло улучшение растворимости в воде или времени циркуляции потенциальных лекарств.Пегилирование является полезным подходом для достижения этой цели в клинических системах доставки лекарств, таких как пегилированный интерферон α-2b или пегилированные липосомы. 74,75 Галиация лекарств может быть новым классом лекарственно-полимерных платформ для системы доставки, нацеленной на CD44. В противоопухолевых исследованиях ГК-нимесулид может ингибировать рост опухоли НТ-29, но не может полностью уничтожить всю опухоль. Для терапии рака может потребоваться дальнейшее комбинированное лечение ГК-нимесулид с современными химиотерапевтическими препаратами, такими как 5-ФУ или иринотекан.После комбинации с ГК-нимесулид можно уменьшить дозу химиотерапевтических препаратов для эффективного противоопухолевого лечения, тем самым уменьшая побочные эффекты химиотерапии. Соответствующие исследования продолжаются в нашей лаборатории.

Заключение

В нашем исследовании мы успешно преодолели ограничение гидрофильности нимесулида, используя конъюгированную систему доставки лекарство-ГК с помощью карбодиимидного связывания, и структура ГК-нимесулида была охарактеризована с помощью 1 H ЯМР 400 МГц и TOCSY.Конъюгат ГК-нимесулид продемонстрировал высокую селективность в отношении опухолей HT-29 со сверхэкспрессией CD44 в отношении индукции мощной клеточной токсичности in vitro. Что касается исследований in vivo, меченая красителем ГК демонстрировала накопление в опухоли, как это наблюдалось с помощью IVIS, а ГК-нимесулид проявляла значительную противоопухолевую активность за счет механизмов апоптоза без заметных морфологических различий в печени или почках у мышей с ксенотрансплантатом НТ-29. Таким образом, системы доставки ГК-нимесулид обладают большим потенциалом в качестве нового класса биоконъюгированных и нацеленных на опухоль химиотерапевтических препаратов для лечения рака.

Подтверждение

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и технологий (103-2113-M-005-008-MY3). Мы также благодарим Holy Stone Healthcare Co., Ltd. за предоставление ГК.

Раскрытие информации

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этой работе.


Каталожные номера

1.

Чанг Ю.Т., Ценг Х.К., Хуан К.С. и др. Относительное подавление генов апоптоза и аутофагии при колоректальном раке. Евро J Clin Invest . 2011;41(1):84–92.

2.

Андре Т., Бони С., Мунеджи-Будьяф Л. и др. Оксалиплатин, фторурацил и лейковорин в качестве адъювантной терапии рака толстой кишки. N Английский J Med . 2004;350(23):2343–2351.

3.

Douillard JY, Cunningham D, Roth AD, et al. Иринотекан в сочетании с фторурацилом по сравнению с монотерапией фторурацилом в качестве терапии первой линии при метастатическом колоректальном раке: многоцентровое рандомизированное исследование. Ланцет . 2000;355(9209):1041–1047.

4.

Li J, Hou N, Faried A, Tsutsumi S, Kuwano H. Ингибирование аутофагии усиливает химиотерапию 5-фторурацилом при раке толстой кишки человека в модели in vitro и in vivo. Евро J Рак . 2010;46(10):1900–1909.

5.

Лонгли Д.Б., Аллен В.Л., Джонстон П.Г. Лекарственная устойчивость, прогностические маркеры и фармакогеномика при колоректальном раке. Биохим Биофиз Акта . 2006;1766(2):184–196.

6.

Herrera-Gayol A, Jothy S. Белки адгезии в биологии рака молочной железы: вклад CD44. Опыт Мол Патол . 1999;66(2):149–156.

7.

Гудисон С., Уркиди В., Тарин Д. Молекулы клеточной адгезии CD44. Мол Патол . 1999;52(4):189–196.

8.

Алвес С.С., Яковлев С., Медведь Л., Константинопулос К. Биомолекулярная характеристика связывания CD44-фибрин(оген): различные молекулярные требования опосредуют связывание стандартных и вариантных изоформ CD44 с иммобилизованным фибрин(огеном). J Биол Хим . 2009;284(2):1177–1189.

9.

Cheng C, Sharp PA. Регуляция альтернативного сплайсинга CD44 с помощью SRm160 и его потенциальная роль в инвазии опухолевых клеток. Мол Селл Биол . 2006;26(1):362–370.

10.

Aruffo A, Stamenkovic I, Melnick M, Underhill CB, Seed B. CD44 является основным поверхностным клеточным рецептором гиалуроновой кислоты. Сотовый . 1990;61(7):1303–1313.

11.

Понта Х., Шерман Л., Херрлих П.А. CD44: от молекул адгезии до сигнальных регуляторов. Nat Rev Mol Cell Biol . 2003;4(1):33–45.

12.

Далерба П., Дилла С.Дж., Парк И.К. и др. Фенотипическая характеристика стволовых клеток колоректального рака человека. Proc Natl Acad Sci U S A . 2007;104(24):10158–10163.

13.

Merlos-Suarez A, Barriga FM, Jung P, et al. Сигнатура стволовых клеток кишечника идентифицирует стволовые клетки колоректального рака и предсказывает рецидив заболевания. Стволовая клетка .2011;8(5):511–524.

14.

Wang C, Xie J, Guo J, Manning HC, Gore JC, Guo N. Оценка CD44 и CD133 в качестве маркеров раковых стволовых клеток для колоректального рака. Oncol Rep . 2012;28(4):1301–1308.

15.

Misra S, Heldin P, Hascall VC, et al. Взаимодействия гиалуронан-CD44 как потенциальные мишени для терапии рака. ФЕБС J . 2011;278(9):1429–1443.

16.

Liu K, Wang ZQ, Wang SJ, et al. Наночастицы диоксида кремния, меченные гиалуроновой кислотой, в терапии рака толстой кишки: оценка терапевтической эффективности. Международная ассоциация наномедицины . 2015;10:6445–6454.

17.

Turley EA, Noble PW, Bourguignon LY. Сигнальные свойства рецепторов гиалуроновой кислоты. J Биол Хим . 2002;277(7):4589–4592.

18.

Сегура Т., Андерсон Б.К., Чанг П.Х., Уэббер Р.Э., Шулл К.Р., Ши Л.Д. Гидрогели с поперечно-сшитой гиалуроновой кислотой: стратегия функционализации и паттерна. Биоматериалы . 2005;26(4):359–371.

19.

Underhill C. CD44: рецептор гиалуроновой кислоты. J Cell Sci . 1992; 103 (часть 2): 293–298.

20.

Kawada C, Yoshida T, Yoshida H, et al.Проглатываемый гиалуронан увлажняет сухую кожу. Нутр J . 2014;13:70.

21.

Кота Д.Дж., Прабхакара К.С., Кокс К.С., Олсон С.Д. МСК и гиалуронан: объединяются для нового терапевтического потенциала? Int J Biochem Cell Biol . 2014; 55:1–10.

22.

Эллисон Д.Д., Гранде-Аллен К.Дж. Рассмотрение. Гиалуронан: мощный инструмент тканевой инженерии. Ткань Eng .2006;12(8):2131–2140.

23.

Сун С., Ци Х., Сюй Дж. и др. Наноносители на основе гиалуронана с нацеливанием на раковые клетки со сверхэкспрессией CD44. Фарм Рез . 2014;31(11):2988–3005.

24.

Xu K, Lee F, Gao SJ, Chung JE, Yano H, Kurisawa M. Гидрогели с гиалуроновой кислотой и тирамином для инъекций, содержащие интерферон-альфа2а, для лечения рака печени. J Расцепитель управления .2013;166(3):203–210.

25.

Yoon HY, Kim HR, Saravanakumar G, et al. Биовосстанавливаемые конъюгаты гиалуроновой кислоты в качестве носителя миРНК для нацеливания на опухоль. J Расцепитель управления . 2013;172(3):653–661.

26.

Manju S, Sreenivasan K. Конъюгация куркумина с гиалуроновой кислотой повышает его растворимость в воде и стабильность. J Коллоидный интерфейс Sci .2011;359(1):318–325.

27.

Сараванакумар Г., Дипаган В.Г., Джаякумар Р., Парк Дж.Х. Конъюгаты на основе гиалуроновой кислоты для адресной доставки лекарств и визуализации опухоли. Дж Биомед Нанотехнолог . 2014;10(1):17–31.

28.

Ли Х, Ли К, Парк Т.Г. Мицеллы конъюгата гиалуроновой кислоты и паклитаксела: синтез, характеристика и противоопухолевая активность. Биоконъюг Хим .2008;19(6):1319–1325.

29.

Стерн Р., Асари А.А., Сугахара К.Н. Фрагменты гиалуроновой кислоты: информационная система. Евро J Cell Biol . 2006;85(8):699–715.

30.

Коуман М.К., Мацуока С. Экспериментальные подходы к структуре гиалуроновой кислоты. Карбогидр Рез . 2005;340(5):791–809.

31.

Западный округ Колумбия, Хэмпсон ИН, Арнольд Ф., Кумар С.Ангиогенез, индуцированный продуктами деградации гиалуроновой кислоты. Наука . 1985; 228(4705):1324–1326.

32.

Rothman I, Stanford JL, Kuniyuki A, Berger RE. Самоотчет простатита и его факторов риска в случайной выборке мужчин среднего возраста. Урология . 2004;64(5):876–879; обсуждение 879–880.

33.

Лофтус Е.В. мл. Эпидемиология и факторы риска колоректальной дисплазии и рака при язвенном колите. Гастроэнтерол Клин Норт Ам . 2006;35(3):517–531.

34.

Дэвис Р., Брогден Р.Н. Нимесулид. Обновление его фармакодинамических и фармакокинетических свойств и терапевтической эффективности. Наркотики . 1994;48(3):431–454.

35.

Джаниорио П., Заппа Р., Сакко О., Фрегонезе Б., Скарикабароцци И., Росси Г.А. Жаропонижающая и противовоспалительная эффективность нимесулида по сравнению с парацетамолом при симптоматическом лечении острых респираторных инфекций у детей. Наркотики . 1993; 46 (Приложение 1): 204–207.

36.

Окадзима Э., Денда А., Озоно С. и др. Химиопрофилактическое действие нимесулида, селективного ингибитора циклооксигеназы-2, на развитие карциномы мочевого пузыря крыс, инициированное N-бутил-N-(4-гидроксибутил)нитрозамином. Рак Res . 1998;58(14):3028–3031.

37.

Fukutake M, Nakatsugi S, Isoi T, et al.Подавляющее действие нимесулида, селективного ингибитора циклооксигеназы-2, на индуцированный азоксиметаном канцерогенез толстой кишки у мышей. Канцерогенез . 1998;19(11):1939–1942.

38.

Накацуги С., Охта Т., Кавамори Т. и др. Химиопрофилактика нимесулидом, селективным ингибитором циклооксигеназы-2, индуцированного 2-амино-1-метил-6-фенилимидазо[4,5-b]пиридином (PhIP) канцерогенеза молочной железы у крыс. Наука о раке .2000;91(9):886–892.

39.

Furukawa F, Nishikawa A, Lee IS, et al. Ингибитор циклооксигеназы-2, нимесулид, ингибирует постинициационную фазу индуцированного N-нитрозобис(2-оксопропил)амином канцерогенеза поджелудочной железы у хомяков. Int J Рак . 2003;104(3):269–273.

40.

Li JY, Wang XZ, Chen FL, Yu JP, Luo HS. Нимесулид ингибирует пролиферацию путем индукции апоптоза и остановки клеточного цикла в клеточной линии аденокарциномы желудка человека. Мир J Гастроэнтерол . 2003;9(5):915–920.

41.

Jia-Jun T, Su-Mei L, Liang Y, et al. Нимесулид ингибировал рост клеток гипофарингеальной карциномы посредством подавления экспрессии сурвивина. Oncol головы и шеи . 2012;4:7.

42.

Zhong B, Cai X, Chennamaneni S, et al. От ингибитора ЦОГ-2 нимесулида до мощного противоракового средства: синтез, in vitro, in vivo и фармакокинетическая оценка. Евро J Med Chem . 2012;47(1):432–444.

43.

Li XH, Li JJ, Zhang HW и др. Нимесулид ингибирует рост опухоли у мышей с имплантированной гепатомой: сверхэкспрессия Bax по сравнению с Bcl-2. Акта Фармакол Син . 2003;24(10):1045–1050.

44.

Fallavena PRB, Schapoval EES. Определение pKa нимесулида в смесях метанол-вода методом потенциометрического титрования. Int J Фарм . 1997;158(1):109–112.

45.

Неха А., Сингх И., Шарма М., Тарун Г. Подход к улучшению водорастворимости нимесулида в твердой дисперсии с ПЭГ. ИОСР Дж Фарм . 2012;2(2):153–154.

46.

Macpherson D, Best SA, Gedik L, Hewson AT, Rainsford K, Parisi S. Биотрансформация и фармакокинетика 14C-нимесулида у людей после однократного перорального приема. J Препарат Метаб Токсикол . 2013;4:140.

47.

Луо Л., Тао В., Буркаиб Н., Луо Ю. Дизайн и определение состава нимесулида для инъекций. Пак J Pharm Sci . 2015;28(4):1195–1201.

48.

Cignarella G, Vianello P, Berti F, Rossoni G. Синтез и фармакологическая оценка производных, структурно родственных нимесулиду. Евро J Med Chem . 1996;31(5):359–364.

49.

Pericherla S, Mareddy J, Rani DPR, Gollapudi PV, Pal S. Химические модификации нимесулида. J Бразилия Chem Soc . 2007;18(2):384–390.

50.

Луо Ю., Зибелл М.Р., Прествич Г.Д. Противоопухолевый биоконъюгат гиалуроновой кислоты и таксола, нацеленный на раковые клетки. Биомакромолекулы . 2000;1(2):208–218.

51.

Lim EK, Kim HO, Jang E, et al. Магнитные нанокластеры, модифицированные гиалуроновой кислотой, для выявления рака молочной железы со сверхэкспрессией CD44 с помощью МРТ. Биоматериалы . 2011;32(31):7941–7950.

52.

Луо Ю, Прествич Г.Д. Синтез и селективная цитотоксичность противоопухолевого биоконъюгата гиалуроновой кислоты. Биоконъюг Хим . 1999;10(5):755–763.

53.

Пуяни Т., Прествич Г.Д. Функционализированные производные олигосахаридов гиалуроновой кислоты: носители лекарств и новые биоматериалы. Биоконъюг Хим . 1994;5(4):339–347.

54.

Национальный исследовательский совет (США). Комитет по обновлению руководства по уходу и использованию лабораторных животных, Институт исследований лабораторных животных (США), National Academy Press (U.С.). Руководство по уходу и использованию лабораторных животных . Вашингтон, округ Колумбия: Издательство национальных академий; 2011.

55.

Nakajima TE, Yasunaga M, Kano Y, et al. Синергетическая противоопухолевая активность новых полимерных мицелл, содержащих SN-38, NK012, в сочетании с 5-фторурацилом в мышиной модели колоректального рака по сравнению с активностью иринотекана плюс 5-фторурацила. Int J Рак . 2008;122(9):2148–2153.

56.

Sharma R, Adam E, Schumacher U. Действие 5-фторурацила на клетки рака толстой кишки человека HT29, выращенные у мышей SCID: митоз, апоптоз и дифференцировка клеток. Бр J Рак . 1997;76(8):1011–1016.

57.

Леонелли Ф., Ла Белла А., Франческанджели А. и др. Новый и легко доступный класс водорастворимых биоконъюгатов путем связывания паклитаксела с гиалуроновой кислотой через линкер, полученный из 4-гидроксибутановой кислоты. Хелв Чим Акта . 2005;88(1):154–159.

58.

Цай С., Алховян А.А.Б., Ян К., Форрест В.К.М., Шнайдер Ю., Форрест М.Л. Клеточное поглощение и интернализация конъюгатов доксорубицина и цисплатина на основе гиалуроновой кислоты. J Наркологическая мишень . 2014;22(7):648–657.

59.

Wang W, Cameron AG, Ke S. Разработка флуоресцентных аналогов гиалуроновой кислоты для исследований гиалуроновой кислоты. Молекулы . 2012;17(2):1520–1534.

60.

Zhao MD, Cheng JL, Yan JJ, et al. Функциональный реагент гиалуроновой кислоты конъюгат хитозан-ПЭИ с AQP2-миРНК подавлял образование эндометриоидных поражений. Международная ассоциация наномедицины . 2016;11:1323–1336.

61.

Эль-Дакдуки М.Х., Ся Дж., Чжу Д.К. и др. Оценка in vivo эффективности наночастиц гиалуроновой кислоты, нагруженных доксорубицином. Интерфейсы приложений ACS . 2014;6(1):697–705.

62.

Ши Дж., Ма Р., Ван Л. и др. Применение углеродных нанотрубок, производных гиалуроновой кислоты, в фотодинамической терапии на основе монометилового эфира гематопорфирина для лечения рака in vivo и in vitro. Международная ассоциация наномедицины . 2013; 8: 2361–2373.

63.

Карини М., Альдини Г., Стефани Р., Маринелло С., Фачино Р.М.Масс-спектрометрическая характеристика и определение с помощью ВЭЖХ основных метаболитов нимесулида в моче у человека. J Pharm Biomed Anal . 1998;18(1–2):201–211.

64.

Mizuno K, Katoh M, Okumura H, et al. Метаболическая активация бензодиазепинов с помощью CYP3A4. Препарат Метаб Dispos . 2009;37(2):345–351.

65.

Демирылмаз И., Туран М.И., Кисаоглу А., Гулапоглу М., Йылмаз И., Сулейман Х.Защитный эффект нимесулида против ишемии/реперфузии печени у крыс: влияние на оксиданты/антиоксиданты, мутацию ДНК и уровни ЦОГ-1/ЦОГ-2. Pharmacol Rep . 2014;66(4):647–652.

66.

Licata A, Calvaruso V, Cappello M, Craxi A, Almasio PL. Клиническое течение и исходы медикаментозного поражения печени: нимесулид как первый участвующий препарат. Раскопки печени . 2010;42(2):143–148.

67.

Mingatto FE, Rodrigues T, Pigoso AA, Uyemura SA, Curti C, Santos AC. Критическая роль митохондриального энергетического нарушения в токсичности нимесулида для гепатоцитов. J Pharmacol Exp Ther . 2002;303(2):601–607.

68.

Mingatto FE, dos Santos AC, Rodrigues T, Pigoso AA, Uyemura SA, Curti C. Влияние нимесулида и его восстановленного метаболита на митохондрии. Бр Дж Фармакол .2000;131(6):1154–1160.

69.

Li F, Chordia MD, Huang T, Macdonald TL. Исследования нимесулида in vitro для понимания идиосинкразической гепатотоксичности: образование и конъюгация дииминохинона. Chem Res Toxicol . 2009;22(1):72–80.

70.

Shaik MS, Chatterjee A, Singh M. Влияние селективного ингибитора циклооксигеназы-2, нимесулида, на рост опухолей легких и их экспрессию циклооксигеназы-2 и пролифератора пероксисом рецептор-гамма. Клин Рак Res . 2004;10(4):1521–1529.

71.

Du L, Wang H, He L, et al. CD44 имеет функциональное значение для стволовых клеток колоректального рака. Клин Рак Res . 2008;14(21):6751–6760.

72.

Wielenga VJ, Heider KH, Offerhaus GJ, et al. Экспрессия вариантов белков CD44 при колоректальном раке человека связана с прогрессированием опухоли. Рак Res . 1993;53(20):4754–4756.

73.

Li W, Yi X, Liu X, Zhang Z, Fu Y, Gong T. Наночастицы гиалуроновой кислоты, связывающие ионы, для направленной терапии опухолей. J Расцепитель управления . 2016; 225:170–182.

74.

Билак С.С., Смеланд С., Уилан Дж.С. и др. Метотрексат, доксорубицин и цисплатин (MAP) плюс поддерживающая терапия пегилированным интерфероном альфа-2b по сравнению с монотерапией MAP у пациентов с операбельной остеосаркомой высокой степени злокачественности и хорошим гистологическим ответом на предоперационную MAP: первые результаты рандомизированного контролируемого исследования EURAMOS-1 с хорошим ответом. J Клин Онкол . 2015;33(20):2279–2287.

75.

Поведа А.М., Селле Ф., Хилперт Ф. и др. Бевацизумаб в сочетании с еженедельным введением паклитаксела, пегилированного липосомального доксорубицина или топотекана при резистентном к платине рецидивирующем раке яичников: анализ химиотерапевтической когорты рандомизированного исследования фазы III AURELIA. J Клин Онкол . 2015;33(32):3836–3838.

Дополнительные материалы

Результаты спектра ГПХ (рис. S1A) показывают, что время удерживания гиалуроновой кислоты (ГК)-нимесулида сходно с исходной ГК.Это указывает на то, что молекулярная масса явно не изменится. Спектр ГПХ (рис. S1B) показывает, что нимесулид был конъюгирован с ГК путем образования амидной связи.

Рисунок S1 ГПХ-спектр HAH-нимесулида и HAH, образцы оценивались с помощью ( A ) детектора показателя преломления и ( B ) фотодиодной матрицы.
Сокращения: КПК, фотодиодная матрица; РИ, показатель преломления.

Результаты показали, что через 3 часа инкубации флуоресцеинизотиоцианат (FITC) + клеток в HT-29 и HCT-15 составил 66.8% и 36,3% (рис. S2) соответственно. Через 6 и 24 ч инкубации экспрессия клеток FITC + увеличилась (рис. S2). Однако средняя интенсивность флуоресценции в группах HT-29, обработанных HAH-дигидразидом адипиновой кислоты (ADH)-FITC, была выше, чем в группах HCT-15. Это означает, что количество поглощения HAH-ADH-FITC в клетках HT-29 было выше, чем в клетках HCT-15. Эти результаты свидетельствуют о том, что поглощение HAH-ADH-FITC клетками не только регулировалось путем лиганд-рецептор, но также опосредовалось эндоцитозом.

Рисунок S2 Клеточное поглощение HAH-ADH-FITC клетками HT-29 и HCT15.
Сокращения: ADH, дигидразид адипиновой кислоты; FITC, изотиоцианат флуоресцеина; MIF, средняя интенсивность флуоресценции.

Нимесулид ингибирует пролиферацию и индуцирует апоптоз клеток рака поджелудочной железы за счет усиления экспрессии PTEN

Введение

Рак поджелудочной железы является одним из наиболее распространенных заболеваний человека. злокачественные новообразования желудочно-кишечного тракта и четвертая по значимости причина случаев смертности от рака во всем мире (1).В Китае заболеваемость раком поджелудочной железы занимает седьмое место среди злокачественных новообразований, а рак поджелудочной железы — шестое. ведущая причина смертности среди всех видов рака (2). Кроме того, частота панкреатических рак продемонстрировал тенденцию к росту в последние годы (3). Первичные характеристики поджелудочной железы рака включают позднюю диагностику, сильную местную инвазию, раннюю метастазирование, высокая смертность, плохой прогноз и низкая долгосрочная выживание (4). По сравнению с другими общие методы лечения, включая химиотерапию, лучевую терапию и биологическая терапия (5–7), хирургическое иссечение считается наиболее эффективный вариант в настоящее время, но только 10-15% пациентов подвергаются полная резекция опухоли (8).Несмотря на доступные методы лечения, 5-летняя выживаемость составляет около 5%. (8). Кроме того, в течение 7 лет после операции по поводу рака поджелудочной железы смертность среди больных составляет ~100% (9,10). Поэтому необходимо развивать более эффективное лечение рака поджелудочной железы.

Как было показано ранее, сверхэкспрессия Ген простагландин-эндопероксидсинтазы 2 (ЦОГ-2) может быть связаны с онкогенезом и прогрессированием рака молочной железы, предстательной железы и рак легких (11–13). Кроме того, ЦОГ-2 считается терапевтическая мишень для профилактики рака поджелудочной железы (14,15).Нимесулид является селективным ингибитором ЦОГ-2, который может задерживать прогрессирование поражений-предшественников рака поджелудочной железы, ингибировать клеточные пролиферацию и индуцировать апоптоз (16–18). Гомолог фосфатазы и тензина (PTEN) представляет собой липидфосфатазу, которая играет роль в подавлении опухоли (19). Однако эффект ЦОГ-2 ингибиторов PTEN в контексте рака поджелудочной железы остается быть выяснены.

В настоящем исследовании влияние нимесулида на пролиферация и апоптоз клеток рака поджелудочной железы исследованы с целью выяснения возможности PTEN-ассоциированное влияние нимесулида на рак поджелудочной железы.

Материалы и методы
Реагенты и клеточные культуры

Нимесулид был приобретен у Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Дармштадт, Германия). Диметилсульфоксид (ДМСО), МТТ и Набор аннексина V/мертвых клеток для апоптоза был приобретен в Ханчжоу. Multi Sciences Biotech Co., Ltd. (Ханчжоу, Китай). Начальный антитела в разведении 1:1000 против расщепленной каспазы-3 (кат. нет. AC033), прокаспаза-3 (кат. № AF1261), PTEN (кат. № AF1426), ЦОГ-2 (номер по каталогу AF1924) и рост эндотелия сосудов фактор (VEGF; кат.нет. AF1309), Bcl-2 (каталожный номер AB112), Bcl-2 ассоциированный белок X (Bax; кат. № AB026) и β-актин (кат. № AA128) использовались в настоящем исследовании. Следующий вторичный антитела (конъюгированные с пероксидазой хрена Goat Anti-Rabbit Иммуноглобулин G, 1:5000; Кот. нет. А0208; Пероксидаза хрена конъюгированный козий антимышиный иммуноглобулин G; 1:5000; Кот. нет. A0216). Все антитела были предоставлены компанией Beyotime. Институт биотехнологии (Хаймэнь, Китай) Рак поджелудочной железы человека клеточная линия PANC-1 была получена из Коллекции типовых культур Китайская академия наук (Шанхай, Китай).Клетки были культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с 10% эмбриональная бычья сыворотка (FBS), пенициллин 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл стрептомицина во влажной атмосфере при 37°С с 5% СО2. Были приобретены DMEM, FBS и 0,25% трипсин-ЭДТА. от Gibco (Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США).

Анализ клеточной пролиферации

Жизнеспособность клеток PANC-1 после обработки нимесулид оценивали с помощью МТТ-анализа, как и ранее. описан (20). Кратко, 5×103 клеток/лунку (100 мкл) высевали в 96-луночные планшеты. с различными концентрациями нимесулида (0, 25, 50, 100, 200 и 400 мкмоль/л).В качестве контрольной обработки использовали ДМСО. Следующий инкубации при 37°С в течение 48 ч, в каждый раствор добавляли по 20 мкл МТТ (5 мг/мл). затем инкубировали при 37°С в течение 4 часов. ДМСО использовали для растворяют пурпурный формазан и измеряют оптическую плотность при длина волны 490 нм с использованием устройства для считывания микропланшетов (Synergy HTX; BioTek Instruments, Inc., Винуски, Вирджиния, США). Результаты выражаются как скорости ингибирования в соответствии со следующей формулой: Ингибирование показатель (%) = 1-(обработка OD-пустая OD)/(контрольная OD-пустая OD) × 100%.

Анализ цепной схемы ДНК

Клетки были собраны после обработки разные концентрации нимесулида при 37°С в течение 48 ч. То надосадочную жидкость отбрасывали после центрифугирования при скорости 1000×g в течение 5 мин при комнатной температуре, осадок промывали с PBS (0,01 М, рН 7,4). Клетки инкубировали с 500 мкл лизиса. буфер [0,5 М Трис-HCl (pH 8,0), 0,02 ммоль/л ЭДТА и 1% NP-40] в водяная баня при 55°С в течение 16 часов. Растворы центрифугировали при скорость 12000×g в течение 5 мин при 4°C и обработка РНКазой А (конечная концентрация 20 мг/л; кат.нет. Р6148; Сигма-Олдрич) с 1% SDS и протеиназа К (конечная концентрация 20 мг/л; кат. Р2308; Сигма-Олдрич). Всего 60 мкл 3 М ацетата натрия и 600 Добавляли мкл ледяного абсолютного этанола и образцы инкубировали. при -20°С в течение не менее 1 ч с последующим центрифугированием при скорости 12000×g в течение 20 мин при 4°C. Полученные осадки ДНК растворяли в буфере TE (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA при pH 7,4) и ДНК лестницу разделяли электрофорезом на 2% агарозном геле. (21).

Анализ апоптоза

Апоптоз клеток PANC-1 был обнаружен с помощью вышеупомянутый Аннексин V/йодид пропидия (ИП) Обнаружение апоптоза Комплект.Вкратце, клетки подвергали воздействию различных концентраций (50, 100, 200 и 400 мкмоль/л) нимесулида в течение 48 ч при 37°С. Контроль клетки обрабатывали ДМСО. Клетки собирали и дважды промывали с ПБС. В общей сложности ресуспендировали 5×105 клеток/мл. 400 мкл буфера для связывания с 5 мкл аннексина V-флуоресцеина изотиоцианата (FITC) и 1 мкл PI (100 мкг/мл) в темноте. После инкубации при 37°С в течение 15 мин клеточный апоптоз прекращался. выявляется с помощью проточной цитометрии (FACSCalibur; BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США) и анализировали с помощью CellQuest 3.3 ПО (BD биологические науки).

Вестерн-блот анализ

Клетки лизировали методом радиоиммунопреципитации лизат (Институт биотехнологии Beyotime) для извлечения всего белок. Затем определяли концентрацию общего белка. с помощью набора для анализа белка BCA (Beyotime Institute of Биотехнология). После этого загружали 40 мкг белка и разделяли на 12% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозу мембраны. Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в течение 1 ч. при 37°C и зондировали специфическими первичными антителами против ЦОГ-2, Bcl-2, Bax, VEGF, расщепленная каспаза-3, прокаспаза-3, PTEN и β-актина при 4°С в течение ночи.В последующем мембраны были инкубируют при 37°С с соответствующими вторичными антителами для 1 час. Целевые полосы были визуализированы с использованием расширенного решение для хемилюминесценции (Qihai Biotec, Шанхай, Китай) и Программное обеспечение Gel-Pro-Analyzer (Bethesda, MD, USA) использовалось для измерить относительную интенсивность полос. Каждый целевой белок был нормирован на соответствующую полосу β-актина. Белок из необработанные клетки загружали на каждый гель для сравнения.

Статистический анализ

Статистический анализ выполнен с помощью GraphPad Программное обеспечение Prism (версия 5.0; GraphPad Software, Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n≥3). Односторонний дисперсионный анализ с последующим множественным анализом Тьюки. тест сравнения был использован для сравнения различий между группами. Считалось, что P<0,05 указывает на статистически значимое разница.

Результаты
Нимесулид ингибирует пролиферацию PANC-1 клетки

Результаты анализов МТТ показали, что ингибирующее действие нимесулида на пролиферацию PANC-1 клетки можно было наблюдать при дозе 50–400 мкмоль/л (табл. I).Тормозящий эффект проявляется в зависимым от концентрации образом.

Таблица I.

Нимесулид ингибирует пролиферацию клетки PANC-1 (n=3).

Таблица I.

Нимесулид ингибирует пролиферацию клетки PANC-1 (n=3).

0 6 850 0,912±0,025 а, б
Нимесулид (мкмоль/л) Поглощение Степень ингибирования (%)
0 1.046±0,032 0
25 1,005±0,029 3,5±0,92
12,7±3,29 а, б
100 0,677±0,036 а–в 35,2±4,21 а–в
200 0,532±0,019 а–г 49,1±3,75 а–г
400 0,328±0.016 a–e 68,3±2,87 а–д
Нимесулид индуцирует апоптоз PANC-1 ячейки

ДНК-лэддер продемонстрировал, что характеристики апоптоз возник после 48-часового лечения нимесулидом из концентрация 50–400 мкмоль/л (рис. 1А). Результаты проточной цитометрии показали, что лечение с 200 и 400 мкмоль/л нимесулида в течение 48 ч достоверно увеличивалась ранний апоптоз клеток PANC-1 по сравнению с контрольными клетками (Рисунок.1Б-Г). Приведенные выше результаты показали, что нимесулид может индуцировать ранний и поздний апоптоз клетки PANC-1. Для дальнейшего изучения механизмов, лежащих в основе Нимесулид-индуцированный апоптоз в клетках PANC-1, нижележащие медиаторы в каскаде апоптоза анализировали вестерн-блоттингом (рис. 2). После лечения с 100 и 200 мкмоль/л нимесулида в течение 48 ч, повышение экспрессии Bax и расщепленную каспазу-3 наблюдали соответственно. Выражение прокаспаза-3 и Bcl-2 снижались после лечения 100 и 50–200 мкмоль/л нимесулида соответственно.

Рисунок 2.

Влияние нимесулида на экспрессию расщепленной каспазы-3, прокаспазы-3, Bax и Bcl-2 в клетках PANC-1. (A) Клетки PANC-1 обрабатывали различными концентрациями нимесулид (0, 25, 50, 100, 200 и 400 мкмоль/л) в течение 48 ч и экспрессию белка определяли вестерн-блоттингом. Выражение (B) расщепленной каспазы-3, (C) прокаспазы-3, (D) Bax и (E) Bcl-2 был проанализирован. *P<0,05 и ***P<0,001 по сравнению с контрольной группой.Bax, связанный с Bcl-2 белок X; Bcl-2, В-клеточная лимфома 2.

Нимесулид снижает экспрессию ЦОГ-2 в клетках PANC-1

Экспрессия белка ЦОГ-2 в клетках PANC была снижается после лечения нимесулидом. Следующий обработка 100, 200 или 400 мкмоль/л нимесулида в течение 48 ч, клетки продемонстрировал значительно более низкую экспрессию белка ЦОГ-2 по сравнению с необработанными контрольными клетками (рис. 3). Таким образом, нимесулид подавляет экспрессия ЦОГ-2 в клетках PANC-1.Приведенные выше результаты свидетельствуют о нимесулид может действовать как ингибитор ЦОГ-2 при раке поджелудочной железы клетки.

Нимесулид усиливает экспрессию PTEN и подавляет экспрессию VEGF в клетках PANC-1

Для выяснения механизма, лежащего в основе антипролиферативное и проапоптотическое действие нимесулида, белок определяли экспрессию PTEN и VEGF (рис. 4). После обработки 400 мкмоль/л нимесулида в течение 48 ч экспрессия PTEN повышалась по сравнению с контрольная группа.Экспрессия VEGF значительно снизилась после лечения 100 и 400 мкмоль/л нимесулида. Эти результаты показали, что PTEN и VEGF могут быть вовлечены в антипролиферативные и проапоптотические эффекты нимесулида при ПАНК клетки. Однако экспрессия VEGF была незначительной. после лечения 200 мкмоль/л нимесулида. Это могло быть из-за экспериментальной ошибки, но необходимы дальнейшие исследования для уточнение.

Обсуждение

Рак поджелудочной железы – агрессивное злокачественное заболевание и является одним из типов опухолей, которые внутренне устойчивы к химиотерапия (22,23).Апоптоз, также известный как запрограммированный гибели клеток, играет роль в поддержании гомеостаза как нормального и неопластические клетки (24). Считается, что подавление апоптоза раковых клеток способствует развитие и прогрессирование карциномы путем запуска гена мутации и повышение устойчивости к иммунной цитотоксичности (25). Предыдущие исследования продемонстрировали, что нимесулид способствует апоптозу KOSC-2 в ротовой полости. клетки плоскоклеточного рака (26). Нимесулид также может индуцировать апоптоз, инактивируя Янус киназа 2 / преобразователь сигнала и активатор пути транскрипции 3 в клетках Eca-109 (21).Последовательный с вышеупомянутыми исследованиями, настоящее исследование продемонстрировало Нимесулид может индуцировать апоптоз клеток PANC-1. продемонстрировано в экспериментах с ладдерингом ДНК и аннексином V-FITC/PI. Bax является проапоптотическим белком, тогда как Bcl-2 является антиапоптотическим белком. белок (27). Это было ранее продемонстрировали, что подавление Bcl-2 позволяет олигомеризованный Bax для вставки во внешнюю митохондриальную мембрану и способствуют апоптозу (28). То Настоящее исследование показало, что нимесулид может снижать уровни экспрессии Bcl-2 и повышают уровень экспрессии Bax в Клетки PANC-1, что позволяет предположить, что апоптоз, вызванный нимесулидом, обработка клеток PANC-1 может быть связана с активацией пути митохондриального апоптоза.

Ранее сообщалось, что PTEN может регулируют ангиогенез клеток рака поджелудочной железы человека и что это является супрессором аденокарциномы протоков поджелудочной железы (29,30). Следовательно, усиленная экспрессия PTEN в клетках PANC-1 после лечение нимесулидом указывает на возможную новую роль нимесулид в лечении рака поджелудочной железы в дополнение к ингибирование ЦОГ-2. Основной субстрат, с которым PTEN взаимодействует, представляет собой фосфатидилинозитол (3,4,5)-трифосфат, который вырабатывается действие фосфоинозитид-3-киназ (PI3Ks) (19).PI3K/RAC-альфа сигнальный путь серин/треонин-протеинкиназа (Akt) служит роль в развитии резистентности к терапии рака и ингибирование сигнального пути PI3K/Akt может подавлять рак рост клеток и индуцировать апоптоз при различных типах рака (31–33). Однако эффект усиления PTEN нимесулидом на PI3K/Akt сигнальный апоптоз клеток PANC-1 еще предстоит изучить. разъяснено. Активация пролиферативной активности пероксисом рецептор γ в клетках рака поджелудочной железы человека был продемонстрирован быть связанным с повышенной экспрессией PTEN и апоптозом (34), что говорит о том, что может быть независимым от PI3K/Akt механизмом, лежащим в основе антиапоптотического и PTEN-усиливающий эффект нимесулида в клетках PANC-1.

VEGF, селективный митоген эндотелия сосудов клеток, играет роль в ангиогенезе (35). В эндотелиальных клетках PTEN противодействует Передача сигналов PI3K, которая опосредует экспрессию VEGF и ангиогенез (36). Гиперэкспрессия PI3K и Akt может индуцировать транскрипцию VEGF и способствовать образованию новые кровеносные сосуды (37). Кроме того, после ингибирования PTEN активируется PI3K/Akt, что приводит к делению клеток, увеличению объема клеток, апоптозу и ангиогенез опухоли (38,39). В настоящем исследовании результаты показали, что нимесулид увеличивает экспрессию PTEN, но снижает уровни экспрессии VEGF, что позволяет предположить, что нимесулид может ингибируют ангиогенез клеток PANC-1.

Канцерогенная роль сверхэкспрессии ЦОГ-2 был продемонстрирован при ряде злокачественных новообразований человека, в том числе рак поджелудочной железы (40). Гиперэкспрессия ЦОГ-2 связана с агрессивностью опухоли и рост биологии рака (41,42). Однако в предыдущем исследовании сообщалось, что нимесулид вызывает апоптоз в клетках MIA PaCa-2 (без экспрессии белка COX-2) и Клетки BxPC-3 (высокая экспрессия белка ЦОГ-2), что позволяет предположить, что эффект нимесулида может не зависеть от белка ЦОГ-2 выражение (16).В настоящее время исследование показало, что нимесулид снижает экспрессию ЦОГ-2 и увеличивает экспрессию PTEN, но также приводит к ингибированию пролиферации клеток PANC-1. Кроме того, ЦОГ-2 положительно регулирует передачу сигналов Akt посредством подавление активности PTEN (43) и простагландина Е2 (44). В предыдущем исследовании в клетках трансформируется тирозинкиназой 2 рецептора erb-b2, активация или ингибирование митоген-активируемой протеинкиназы и PI3K/Akt каскады приводили к повышающей и понижающей регуляции ЦОГ-2, соответственно (45).Таким образом, противораковый эффект нимесулида в клетках PANC-1 может быть связан с с взаимодействием между PTEN и ЦОГ-2.

В заключение, результаты настоящего исследования показали, что нимесулид оказывает противоопухолевое действие на клетки PANC-1. В частности, нимесулид подавлял пролиферацию и способствовал апоптозу клеток PANC-1 за счет усиления экспрессии ПТЭН. Кроме того, результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что нимесулид может предотвращать ангиогенез опухоли путем ингибирования экспрессии VEGF.Регуляторные эффекты нимесулида на клетки PANC-1 могут быть связаны с взаимодействиями между PTEN и ЦОГ-2 через Сигнальный путь PI3K/Akt. Однако эта гипотеза требует дальнейшее расследование.

Благодарности

Не применимо.

Финансирование

Настоящее исследование было поддержано грантами, полученными от Национального фонда естественных наук Китая (грант No. 81772232), проект, финансируемый Молодежным доктором Чжэцзянского медицинского колледжа. запуск (грант.нет. 2015B07), проект, финансируемый Образовательным Фонд департамента провинции Чжэцзян (грант № Y201636954) и проект, финансируемый Zhejiang Medicine Health Science и Финансирование технологий (грант № 2013KYAO47).

Наличие данных и материалов

Наборы данных, использованные и/или проанализированные в течение текущего исследование доступно у соответствующего автора на разумных запрос.

Вклад авторов

YC и AS разработали исследование.МС, ТВ и YC провели эксперименты. YC написал статью. ЮК, МС и ТВ просмотрел и отредактировал рукопись. Все авторы прочитаны и одобрены рукопись и соглашаетесь нести ответственность за все аспекты исследования для обеспечения того, чтобы точность или целостность любой части работа должным образом исследована и решена.

Одобрение этики и согласие на участвовать

Не применимо.

Согласие на публикацию

Не применимо.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересы.

Ссылки

1

Сигел Р., Найшадхам Д. и Джемал А.: Рак статистика для латиноамериканцев/латиноамериканцев, 2012. CA Cancer J Clin. 62: 283–298. 2012. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

2

Хэ И, Чжэн Р, Ли Д, Цзэн Х, Чжан С и Чен В.: Заболеваемость и смертность от рака поджелудочной железы в Китай, 2011. Chin J Cancer Res. 27:29–37. 2015. PubMed/NCBI

.

3

Чен В., Чжэн Р., Бааде П.Д., Чжан С., Цзэн H, Bray F, Jemal A, Yu XQ и He J: Статистика рака в Китае, 2015.CA Рак J Clin. 66:115–132. 2016. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

4

Вэй Х, Ван В, Ван Л, Чжан И, Чжан Х, Chen M, Wang F, Yu J, Ma Y и Sun G: МикроРНК-21 индуцирует Резистентность к 5-фторурацилу в клетках рака поджелудочной железы человека регулирующие PTEN и PDCD4. Рак Мед. 5: 693–702. 2016. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

5

Неоптолемос Дж. П., Данн Дж. А., Стокен Д. Д., Алмонд Дж., Линк К., Бегер Х., Басси С., Фалькони М., Педерзоли П., Dervenis C, et al: Адъювантная химиолучевая терапия и химиотерапия в операбельный рак поджелудочной железы: рандомизированное контролируемое исследование.Ланцет. 358: 1576–1585. 2001. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

6

Ван Лаэтем Дж. Л., Хаммел П., Морнекс Ф., Азрия Д., Ван Тинховен Г., Вергауве П., Петерс М., Полус М., Прает М., Мауэр М и др.: Адъювантная терапия только гемцитабином в сравнении с адъювантной терапией на основе гемцитабина химиолучевая терапия после лечебной резекции по поводу рака поджелудочной железы: A рандомизированное исследование фазы II EORTC-40013-22012/FFCD-9203/GERCOR. Дж Клин Онкол. 28:4450–4456. 2010. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

7

Мур М.Дж., Гольдштейн Д., Хэмм Дж., Фигер А., Hecht JR, Gallinger S, Au HJ, Murawa P, Walde D, Wolff RA и др.: Эрлотиниб в комбинации с гемцитабином по сравнению с монотерапией гемцитабином в пациенты с распространенным раком поджелудочной железы: исследование фазы III Группа клинических испытаний Национального института рака Канады.Джей Клин Онкол. 25:1960–1966. 2007. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

8

Sutton JM и Abbott DE: Неоадъювантная терапия терапия рака поджелудочной железы: уроки прошлого и будущие методы лечения. Мир J Гастроэнтерол. 20:15564–15579. 2014. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

9

Камангар Ф., Дорес Г.М. и Андерсон В.Ф.: Модели заболеваемости раком, смертности и распространенности в пяти континентах: определение приоритетов для сокращения неравенства в отношении рака в разных географических регионах мира.Дж. Клин Онкол. 24:2137–2150. 2006. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

10

Идальго М.: Рак поджелудочной железы. Н англ J Мед. 362: 1605–1617. 2010. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

11

Мильетта А, Тоселли М, Раварино Н, Венсия W, Chiecchio A, Bozzo F, Motta M, Torchio B и Bocca C: COX-2 экспрессия в карциномах молочной железы человека: корреляция с клинико-патологические особенности и прогностические молекулярные маркеры.Экспертное мнение по этим целям. 14: 655–664. 2010. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

12

Ричардсен Э., Углехус Р.Д., Дуэ Дж., Буш С. и Busund LT: ЦОГ-2 сверхэкспрессируется при первичном раке предстательной железы. с метастатическим потенциалом и может предсказать выживаемость. Сравнение исследование между ЦОГ-2, ТФР-бета, ИЛ-10 и Ki67. Эпидемиол рака. 34:316–322. 2010. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

13

Чанг Дж., Сюэ М., Ян С., Яо Б., Чжан Б., Chen X, Pozzi A и Zhang MZ: ингибирование 11β-гидроксистероида Дегидрогеназа II типа подавляет канцерогенез легких, блокируя экспрессия опухолевого ЦОГ-2, а также передача сигналов ERK и mTOR пути.ПЛОС Один. 10:e01270302015. Просмотр статьи : Академия Google : PubMed/NCBI

14

Якстайте А., Мазюкене А., Силкунене Г., Кмиелиуте К., Гулбинас А. и Дамбраускас З.: опосредовано HuR посттранскрипционная регуляция как новый потенциальный адъювант Терапевтическая мишень при химиотерапии рака поджелудочной железы. Мир J Гастроэнтерол. 21:13004–13019. 2015. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

15

Ли С., Гу З., Сяо З., Чжоу Т., Ли Дж. и Сун. K: Противоопухолевый эффект и механизм действия ингибитора циклооксигеназы-2. через путь матриксной металлопротеиназы 14 в клетках PANC-1.Международный J Клин Эксп Патол. 8: 1737–1742. 2015. PubMed/NCBI

.

16

Эйбл Г., Ребер Х.А., Венте М.Н. и Хайнс О.Дж.: Селективный ингибитор циклооксигеназы-2 нимесулид индуцирует апоптоз в раковых клетках поджелудочной железы не зависит от ЦОГ-2. Поджелудочная железа. 26:33–41. 2003. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

17

Фунахаши Х., Сатакэ М., Доусон Д., Хюинь Н.А., Ребер Х.А., Хайнс О.Дж. и Эйбл Г.: Замедленное прогрессирование поджелудочной железы внутриэпителиальная неоплазия в условной мышиной модели Kras (G12D) селективным ингибитором циклооксигеназы-2.Рак Рез. 67:7068–7071. 2007. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

18

Эйбл Г., Таката Ю., Борос Л.Г., Лю Дж., Окада Y, Reber HA и Hines OJ: Стимуляция роста ЦОГ-2-отрицательных рак поджелудочной железы селективным ингибитором ЦОГ-2. Рак Рез. 65:982–990. 2005. PubMed/NCBI

.

19

Кисимото Х., Хамада К., Сондерс М., Бэкман С., Сасаки Т., Накано Т., Мак Т.В. и Сузуки А.: Физиологические функции Pten в тканях мыши.Функция клеточной структуры. 28:11–21. 2003. Просмотр статьи : Академия Google : PubMed/NCBI

20

Данг Кью, Сонг В, Сюй Д, Ма И, Ли Ф, Цзэн Дж, Zhu G, Wang X, Chang LS, He D и Li L: кемпферол подавляет рост опухоли рака мочевого пузыря путем ингибирования пролиферации клеток и индуцирующие апоптоз. Мол Карциног. 54:831–840. 2015. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

21

Лю JR, Wu WJ, Liu SX, Zuo LF, Wang Y, Yang JZ и Nan YM: нимесулид ингибирует рост человека клетки карциномы пищевода путем инактивации пути JAK2/STAT3.Патол Res Pract. 211:426–434. 2015. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

22

Сигел Р., Найшадхам Д. и Джемал А.: Рак статистика, 2012. CA Cancer J Clin. 62:10–29. 2012. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

23

Neoptolemos JP, Stocken DD, Bassi C, Гане П., Каннингем Д., Гольдштейн Д., Падбери Р., Мур М.Дж., Гэллинджер S, Mariette C и др.: Адъювантная химиотерапия фторурацилом плюс фолиновая кислота по сравнению с гемцитабином после резекции рака поджелудочной железы: Рандомизированное контролируемое исследование.ДЖАМА. 304: 1073–1081. 2010. Просмотр статьи : Академия Google : PubMed/NCBI

24

Su M, Mei Y и Sinha S: роль взаимосвязь между аутофагией и апоптозом при раке. J Онкол. 2013:1027352013. Просмотр статьи : Академия Google : PubMed/NCBI

25

Сато К., Канеко К., Хирота М., Масамунэ А., Сато А. и Симосегава Т.: Экспрессия сурвивина коррелирует с апоптозом раковых клеток и участвует в развитии клеточные опухоли протоков поджелудочной железы человека.Рак. 92: 271–278. 2001. Просмотр статьи : Академия Google : PubMed/NCBI

26

Юань Зи, Чен Д, Чен Икс и Вэй И: Роман Комбинация винкристина и ингибитора ЦОГ-2 нимесулида обеспечивает синергетические антипролиферативные и проапоптотические эффекты в KOSC-2 клетки плоскоклеточного рака полости рта. Int J Clin Exp Me. 9: 877–887. 2016.

27

Кумар С., Эроглу Э., Рд С.Дж., Стоукс Дж.А. III, Scissum-Gunn K, Saldanha SN, Singh UP, Manne U, Ponnazhagan S и Мишра М.К.: Ресвератрол вызывает митохондриально-опосредованное, каспазо-независимый апоптоз в клетках рака предстательной железы мышей.Онкотаргет. 8:20895–20908. 2017. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

28

Бхола П.Д. и Летай А.: Митохондрии-судьи и исполнители камеральных смертных приговоров. Мол Ячейка. 61: 695–704. 2016. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

29

Ма Дж., Савай Х., Очи Н., Мацуо Ю., Сюй Д., Ясуда А., Такахаши Х., Вакасуги Т. и Такеяма Х.: PTEN регулирует ангиогенез через сигнальный путь PI3K/Akt/VEGF у человека клетки рака поджелудочной железы.Мол Селл Биохим. 331: 161–171. 2009. Просмотр статьи : Академия Google : PubMed/NCBI

30

Ин Х., Элпек К.Г., Винджамури А., Циммерман SM, Chu GC, Yan H, Fletcher-Sananikone E, Zhang H, Liu Y, Wang W, и др.: PTEN является основным супрессором опухоли в протоках поджелудочной железы. аденокарциному и регулирует сеть цитокинов NF-κB. Рак Дисков. 1: 158–169. 2011. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

31

Cheng TC, Lai CS, Chung MC, Kalyanam N, Majeed M, Ho CT, Ho YS и Pan MH: Мощный противораковый эффект 3′-гидроксиптеростильбен в опухолях ксенотрансплантата толстой кишки человека.ПЛОС Один. 9:e1118142014. Просмотр статьи : Академия Google : PubMed/NCBI

32

Гауда Р., Мадхунапантула С.В., Десаи Д., Амин S и Robertson GP: одновременное нацеливание на COX-2 и AKT с использованием селенококсиб-1-GSH для подавления меланомы. Мол Рак Тер. 12:3–15. 2013. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

33

Ходжсон М.С., Дерюгина Е.И., Суарес Э., Лопес С.М., Линь Д., Сюэ Х., Горлов И.П., Ван Ю и Агульник И.Ю.: INPP4B подавляет инвазию клеток рака предстательной железы.Сигнал сотовой связи. 12:612014. Просмотр статьи : Академия Google : PubMed/NCBI

34

Фэрроу Б. и Эверс Б.М.: Активация PPARgamma увеличивает экспрессию PTEN в раковых клетках поджелудочной железы. Biochem Biophys Res Commun. 301: 50–53. 2003. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

35

Лян Д., Чанг Дж. Р., Чин А. Дж., Смит А., Келли C, Weinberg ES и Ge R: Роль роста эндотелия сосудов фактор (VEGF) в васкулогенезе, ангиогенезе и кроветворении в развитие рыбок данио.Мех Дев. 108:29–43. 2001. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

36

Вэнь С., Столаров Дж., Майерс М.П., ​​Су Д.Д., Виглер MH, Tonks NK и Durden DL: PTEN контролирует индуцированные опухолью ангиогенез. Proc Natl Acad Sci USA. 98:4622–4627. 2001. Просмотр статьи : Академия Google : PubMed/NCBI

37

An X, Lv H, Tian J, He X и Ling N: Роль пути PTEN/PI3K/VEGF в развитии синдрома Кавасаки болезнь.Эксперт Тер Мед. 11:1318–1322. 2016. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

38

Карраседо А и Пандольфи ПП: PTEN-PI3K путь: обратных связей и перекрестных переговоров. Онкоген. 27:5527–5541. 2008. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

39

Карнеро А., Бланко-Апарисио К., Реннер О., Link W и Leal JF: сигнальный путь PTEN/PI3K/AKT при раке, терапевтические последствия.Цели лекарств против рака Curr. 8:187–198. 2008. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

40

Song Z, Bhagat G, Quante M, Baik GH, Marrache F, Tu SP, Zhao CM, Chen D, Dannenberg AJ и Wang TC: Потенциальные канцерогенные эффекты сигаретного дыма и шведской сырости нюхательный табак на поджелудочной железе: исследование с использованием модели трансгенных мышей хронический панкреатит. Лаборатория Инвест. 90:426–435. 2010. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

41

Юути А., Лоухимо Дж., Нордлинг С., Ристимяки A и Haglund C: экспрессия циклооксигеназы-2 коррелирует с плохим прогноз при раке поджелудочной железы.Джей Клин Патол. 59:382–386. 2006. Просмотр статьи : Академия Google : PubMed/NCBI

42

Ристимяки А., Сивула А., Лундин Дж., Лундин М., Салминен Т., Хаглунд С., Йоэнсуу Х. и Изола Дж.: Прогноз значение повышенной экспрессии циклооксигеназы-2 в молочной железе рак. Рак Рез. 62:632–635. 2002. PubMed/NCBI

.

43

Li CJ, Chang JK, Wang GJ и Ho ML: Конститутивно экспрессируемый ЦОГ-2 в остеобластах положительно регулирует Передача сигнала Akt посредством подавления активности PTEN.Кость. 48:286–297. 2011. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

44

Во БТ, Мортон Ди младший, Комарагири С, Миллена AC, Leath C и Khan SA: эффекты TGF-β на клетки рака предстательной железы миграция и инвазия опосредуются PGE2 через активацию Путь PI3K/AKT/mTOR. Эндокринология. 154: 1768–1779. 2013. Просмотр статьи : Академия Google : PubMed/NCBI

45

Суббарамайя К., Нортон Л., Джеральд В. и Данненберг А.Дж.: Циклооксигеназа-2 избыточно экспрессируется в HER-2/neu-положительный рак молочной железы: доказательства участия AP-1 и ПЭА3.Дж. Биол. Хим. 277:18649–18657. 2002. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

Tylex 30 мг / 500 мг твердые капсулы – Сводка характеристик продукта (SmPC)

Эта информация предназначена для медицинских работников

Тайлекс 30 мг / 500 мг капсулы, твердые

Каждая капсула содержит 500 мг парацетамола и 30 мг полугидрата фосфата кодеина.

Вспомогательные вещества: метабисульфит натрия (Е223) 0.36 мг/капсула.

Полный список вспомогательных веществ см. в разделе 6.1.

Капсулы твердые.

Твердые желатиновые капсулы с белым непрозрачным корпусом и красной крышечкой, обе с надписью «C30» черного цвета.

Капсулы Тайлекс показаны для использования у пациентов старше 12 лет для лечения острой умеренной боли, которая, как считается, не снимается другими анальгетиками, такими как парацетамол или ибупрофен (отдельно).

Дозировка

Взрослые :

Капсулы Tylex принимаются перорально.Обычная доза составляет одну или две капсулы каждые 4-6 часов при необходимости до максимальной суточной дозы 240 мг кодеина и 4 г парацетамола (до 8 капсул в день).

Продолжительность лечения:

Кодеин следует использовать в самой низкой эффективной дозе в течение кратчайшего периода времени.

Продолжительность лечения должна быть ограничена 3 днями, и если эффективное обезболивание не достигается, пациентам/лицам, осуществляющим уход, следует рекомендовать обратиться к врачу.

Дозировку следует корректировать в зависимости от тяжести боли и реакции пациента. Однако следует иметь в виду, что толерантность к кодеину может развиться при продолжительном использовании и что частота неблагоприятных эффектов зависит от дозы. Дозы кодеина выше 60 мг не дают соразмерного облегчения боли, а лишь продлевают анальгезию и связаны со значительным увеличением частоты нежелательных побочных эффектов.

Пожилой :

То же, что и для взрослых, однако может потребоваться снижение дозы.См. предупреждения.

Детская популяция :

Дети в возрасте до 12 лет: Кодеин не следует применять у детей в возрасте до 12 лет из-за риска опиоидной токсичности из-за изменчивого и непредсказуемого метаболизма кодеина в морфин (см. разделы 4.3 и 4.4).

Дети в возрасте от 12 до 15 лет :

От одной капсулы каждые 6 часов при необходимости до максимум 4 капсул в течение 24 часов.

Дети в возрасте от 16 до 18 лет :

От одной до двух капсул каждые 6 часов, при необходимости, до максимум 8 капсул в течение 24 часов.

Способ применения

Для приема внутрь.

Повышенная чувствительность к действующему веществу (веществам) или любому из вспомогательных веществ, перечисленных в разделе 6.1.

Тайлекс не следует использовать:

– У детей в возрасте до 12 лет.

– Всем педиатрическим пациентам (в возрасте 0–18 лет), перенесшим тонзиллэктомию и/или аденоидэктомию по поводу синдрома обструктивного апноэ сна из-за повышенного риска развития серьезных и опасных для жизни побочных реакций (см. раздел 4.4).

У пациентов, о которых известно, что они являются сверхбыстрыми метаболизаторами CYP2D6.

Состояния, при которых морфин и опиоиды противопоказаны например:

• Острая астма (см. разделы 4.4 и 4.8)

• Угнетение дыхания (см. раздел 4.8)

• Острый алкоголизм (см. разделы 4.4 и 4.5)

• После операции на желчевыводящих путях

• Травмы головы

• Повышенное внутричерепное давление

• Грудное вскармливание (см. раздел 4.6)

Терапия ингибиторами моноаминоксидазы, одновременно или в течение 14 дней.

Риск от одновременного применения седативных препаратов, таких как бензодиазепины или родственные препараты:

Одновременное применение Тайлекса и седативных препаратов, таких как бензодиазепины или родственные им препараты, может привести к седации, угнетению дыхания, коме и смерти.Из-за этих рисков одновременное назначение этих седативных препаратов должно быть зарезервировано для пациентов, для которых альтернативные варианты лечения невозможны.

Если принято решение назначать Тайлекс одновременно с седативными препаратами, следует использовать самую низкую эффективную дозу, а продолжительность лечения должна быть как можно короче.

Необходимо внимательно наблюдать за пациентами на наличие признаков и симптомов угнетения дыхания и седативного эффекта. В связи с этим настоятельно рекомендуется информировать пациентов и лиц, осуществляющих уход за ними, чтобы они знали об этих симптомах (см.5).

Врач, назначающий препарат, должен регулярно оценивать соотношение риска и пользы от дальнейшего использования.

Капсулы Tylex содержат метабисульфит натрия, сульфит, который может вызывать аллергические реакции, включая анафилактические симптомы и опасные для жизни или менее тяжелые приступы астмы у некоторых восприимчивых людей. Общая распространенность чувствительности к сульфитам среди населения в целом неизвестна и, вероятно, низка. Чувствительность к сульфиту чаще наблюдается у астматиков, чем у людей, не страдающих астмой.

Капсулы Tylex

следует использовать с осторожностью у пациентов, чувствительных к действию опиоидов, например пожилые (которые могут быть чувствительны к их центральным и желудочно-кишечным эффектам) и ослабленные пациенты, пациенты с угнетением ЦНС, гипотиреозом, болезнью Аддисона, гипертрофией предстательной железы или стриктурой уретры, миастенией, воспалительными или обструктивными заболеваниями кишечника. Следует также соблюдать осторожность, если планируется длительная терапия.

Следует избегать назначения опиоидных анальгетиков пациентам с заболеваниями желчевыводящих путей.

Рекомендуется соблюдать осторожность при назначении парацетамола пациентам с тяжелой почечной или тяжелой печеночной недостаточностью. Опасность передозировки выше у лиц с алкогольной болезнью печени.

Тяжелое поражение печени может возникнуть при превышении максимальной суточной дозы, при приеме Тайлекса вместе с другим препаратом, содержащим парацетамол, или при приеме Тайлекса при употреблении большого количества алкоголя.

Введение петидина и, возможно, других опиоидных анальгетиков пациентам, принимающим ингибитор моноаминоксидазы (ИМАО), связано с очень тяжелыми, а иногда и фатальными реакциями.Если использование кодеина считается необходимым, следует проявлять большую осторожность у пациентов, принимающих ИМАО, или в течение 14 дней после прекращения приема ИМАО (см. раздел 4.5).

Хотя логически можно предположить, что парацетамол является лучшим альтернативным анальгетиком у пациентов с чувствительностью к аспирину, сообщалось о перекрестных реакциях. Пациентам, у которых подтверждена аспириновая астма, или у которых когда-либо наблюдалась астматическая реакция на аспирин или нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), или у которых имеется высокий риск аспириновой астмы, следует избегать всех продуктов, содержащих аспирин или НПВП, на неопределенный срок.Таким пациентам следует рекомендовать прием парацетамола в низкой или средней дозе (< 1000 мг однократно), если нет противопоказаний.

Метаболизм CYP2D6

При одновременном применении кодеина с ингибиторами изофермента цитохрома P450 CYP2D6 может наблюдаться снижение или потеря терапевтического эффекта кодеина (см. раздел 4.5). Кодеин метаболизируется ферментом печени CYP2D6 в морфин, его активный метаболит. При недостатке или полном отсутствии у больного этого фермента адекватный обезболивающий эффект не будет получен.По оценкам, до 7% населения европеоидной расы может иметь этот дефицит. Однако, если пациент является экстенсивным или сверхбыстрым метаболизатором, существует повышенный риск развития побочных эффектов опиоидной токсичности даже при обычно назначаемых дозах. Эти пациенты быстро превращают кодеин в морфин, что приводит к более высоким, чем ожидалось, уровням морфина в сыворотке крови.

Общие симптомы отравления опиоидами включают спутанность сознания, сонливость, поверхностное дыхание, сужение зрачков, тошноту, рвоту, запор и отсутствие аппетита.В тяжелых случаях это может включать симптомы угнетения кровообращения и дыхания, которые могут быть опасными для жизни и очень редко со смертельным исходом.

Оценки распространенности сверхбыстрых метаболизаторов в различных популяциях приведены ниже:

Население

человек

Распространенность %

Африканский/эфиопский

29%

Афроамериканец

3.от 4% до 6,5%

азиат

от 1,2% до 2%

Кавказец

от 3,6% до 6,5%

Греческий

6,0%

Венгерский

1,9%

Североевропейский

1%-2%

В высоких дозах кодеин обладает большинством недостатков морфина, включая угнетение дыхания.Кодеин может вызывать наркотическую зависимость типа морфина и, следовательно, может стать предметом злоупотребления. Кодеин может ухудшить умственные и/или физические способности, необходимые для выполнения потенциально опасных задач.

Пациентов следует предупредить о том, что в случае передозировки следует немедленно обратиться к врачу из-за риска отсроченного серьезного повреждения печени. Им следует рекомендовать не превышать рекомендуемую дозу, не принимать одновременно другие продукты, содержащие парацетамол, проконсультироваться с врачом, если симптомы сохраняются, и хранить продукт в недоступном для детей месте.

Педиатрическое население:

Tylex следует использовать с особой осторожностью у подростков в возрасте от 12 до 18 лет. Альтернативная медицина должна быть рассмотрена, если это вообще возможно.

Послеоперационное применение у детей

В опубликованной литературе были сообщения о том, что послеоперационное введение кодеина детям после тонзиллэктомии и/или аденоидэктомии по поводу обструктивного апноэ сна приводило к редким, но опасным для жизни нежелательным явлениям, включая смерть (см. также раздел 4.3). Все дети получали дозы кодеина, которые находились в соответствующем диапазоне доз; однако были доказательства того, что эти дети были либо сверхбыстрыми, либо интенсивными метаболизаторами в своей способности метаболизировать кодеин в морфин.

Подростки в возрасте от 12 до 18 лет с нарушением функции дыхания

Кодеин не рекомендуется использовать подросткам в возрасте от 12 до 18 лет, у которых может быть нарушена функция дыхания, включая нервно-мышечные расстройства, тяжелые сердечные или респираторные заболевания, инфекции верхних дыхательных путей или легких, множественные травмы или обширные хирургические вмешательства или ожирение.Эти факторы могут ухудшить симптомы отравления морфином.

Седативные препараты, такие как бензодиазепины или родственные им препараты:

Пациенты, получающие другие депрессанты центральной нервной системы (включая другие опиоидные анальгетики, транквилизаторы, например, бензодиазепины, седативные снотворные средства и алкоголь) одновременно с капсулами Tylex, могут проявлять аддитивный депрессантный эффект, поскольку эффекты депрессантов ЦНС (включая алкоголь) могут усиливаться кодеином. Когда предполагается такая терапия, следует уменьшить дозу одного или обоих препаратов (см.4).

Одновременное применение опиоидов с седативными препаратами, такими как бензодиазепины или родственными препаратами, увеличивает риск седативного эффекта, угнетения дыхания, комы и смерти из-за аддитивного угнетающего действия на ЦНС.

Одновременное применение с миорелаксантами центрального действия может увеличить риск угнетения дыхания.

Одновременное применение ингибиторов ИМАО или трициклических антидепрессантов с кодеином может усилить эффект как антидепрессанта, так и кодеина.Одновременное применение антихолинергических средств и кодеина может привести к паралитической кишечной непроходимости.

ИМАО, принимаемые с петидином, были связаны с тяжелым возбуждением или депрессией ЦНС (включая гипертонию или гипотонию). Хотя это не было зарегистрировано с кодеином, возможно, что подобное взаимодействие может иметь место, и поэтому следует избегать использования кодеина во время приема пациентом ИМАО и в течение 2 недель после прекращения приема ИМАО.

Фармакокинетические исследования показали, что препараты, индуцирующие ферменты, такие как некоторые противоэпилептические препараты (фенитоин, фенобарбитал, карбамазепин), снижают AUC парацетамола в плазме приблизительно до 60 %.грамм. рифампицин и зверобой продырявленный (зверобой) также подозреваются в снижении концентрации парацетамола. Кроме того, риск поражения печени при лечении максимальными рекомендуемыми дозами парацетамола будет выше у пациентов, получающих лечение препаратами, индуцирующими ферменты.

Скорость всасывания парацетамола может быть увеличена метоклопрамидом или домперидоном, а всасывание уменьшено холестирамином.

Антикоагулянтный эффект варфарина и других кумаринов может усиливаться при длительном регулярном ежедневном применении парацетамола с повышенным риском кровотечения; случайные дозы не имеют значительного эффекта.

Одновременное применение кодеина с флуоксетином или пароксетином, бупропионом и метадоном может привести к ингибированию CYP2D6, что приводит к снижению концентрации морфина и, следовательно, к снижению или утрате обезболивающего действия кодеина.

Беременность

Использование капсул Тайлекс не рекомендуется во время беременности, так как безопасность для беременных женщин не установлена.

Кодеин :

Было показано, что кодеин

проникает через плацентарный барьер.Опиоидные анальгетики могут угнетать дыхание новорожденных и вызывать синдром отмены у новорожденных от зависимых матерей.

В качестве меры предосторожности следует избегать использования капсул Tylex в третьем триместре беременности и во время родов.

Грудное вскармливание

Капсулы Тайлекс

не следует применять во время грудного вскармливания (см. раздел 4.3).

Парацетамол выделяется с грудным молоком, но не в клинически значимом количестве.

Кодеин не следует применять во время грудного вскармливания (см. раздел 4.3). В нормальных терапевтических дозах кодеин и его активные метаболиты могут присутствовать в грудном молоке в очень низких дозах и вряд ли окажут неблагоприятное воздействие на грудного ребенка.

Однако, если пациент является сверхбыстрым метаболизатором CYP2D6, более высокие уровни активного метаболита, морфина, могут присутствовать в грудном молоке и в очень редких случаях могут привести к симптомам опиоидной токсичности у младенца, что может привести к летальному исходу. .

Если у матери или у ребенка развиваются симптомы опиоидной интоксикации, следует отменить все препараты, содержащие кодеин, и назначить альтернативные неопиоидные анальгетики. В тяжелых случаях следует рассмотреть вопрос о назначении налоксона для купирования этих эффектов.

Пациентам следует рекомендовать воздержаться от управления транспортными средствами или работы с механизмами при появлении головокружения или седативного эффекта.

Это лекарство может ухудшить когнитивные функции и повлиять на способность пациента безопасно управлять автомобилем.Этот класс лекарств входит в список лекарств, включенных в правила 5a Закона о дорожном движении 1988 года. При назначении этого лекарства пациентам следует сообщить:

• Лекарство может повлиять на вашу способность управлять автомобилем

• Не садитесь за руль, пока не узнаете, как лекарство действует на вас

• Вождение автомобиля под действием этого лекарства является правонарушением

• Однако вы не совершите правонарушение (называемое «законной защитой»), если:

o Лекарство было назначено для лечения медицинских или стоматологических проблем и

o Вы приняли его в соответствии с инструкциями врача и информацией, предоставленной вместе с лекарством, и

o Это не повлияло на вашу способность безопасно управлять автомобилем

Сообщаемые побочные реакции кажутся более выраженными у амбулаторных, чем у неамбулаторных пациентов, и некоторые из этих эффектов могут быть смягчены, если пациент ляжет.

Табличный список побочных реакций приведен ниже:

Класс системных органов

Побочные эффекты (частота неизвестна)

Болезни крови и лимфатической системы

Тромбоцитопения, агранулоцитоз, нейтропения, лейкопения

Нарушения иммунной системы

Может возникнуть анафилактический шок, гиперчувствительность, включая кожную сыпь.

Психические расстройства

Дисфория, эйфория, галлюцинации

Заболевания нервной системы

Головокружение, седативный эффект, головная боль

Болезни уха и лабиринта

Глухота 1

Респираторные заболевания грудной клетки и средостения

Бронхоспазм, одышка

Желудочно-кишечные расстройства

Тошнота, рвота, запор, боль в животе, панкреатит 2 , спазм желчевыводящих путей

Болезни кожи и подкожной клетчатки

Зуд, сыпь, крапивница

Сообщалось об очень редких случаях серьезных кожных реакций.

1 Сообщалось о глухоте у пациентов после длительного применения высоких доз кодеина – парацетамола.

2 Лекарственный панкреатит, связанный с парацетамолом, как сообщается в литературе, является редкой реакцией, возникающей только у пациентов, принимающих сверх рекомендуемых доз. Литературные сообщения также связывают случаи панкреатита с кодеином.

Были случаи бронхоспазма при приеме парацетамола, но они более вероятны у астматиков, чувствительных к аспирину или другим НПВП.

При клиническом применении продуктов, содержащих парацетамол, было несколько сообщений о дискразиях крови, включая тромбоцитопению и агранулоцитоз, но они не обязательно были причинно связаны с парацетамолом.

Анафилаксия, ангионевротический отек и токсический эпидермальный некролиз также были связаны с применением парацетамола.

Продолжительное применение болеутоляющих при головной боли может усилить ее.

Кодеин может вызывать типичные опиоидные эффекты, включая запор, тошноту, рвоту, головокружение, бред, спутанность сознания, сонливость и задержку мочи.Частота и тяжесть определяются дозировкой, продолжительностью лечения и индивидуальной чувствительностью. Известно, что регулярное длительное употребление кодеина приводит к зависимости и толерантности. При прекращении лечения могут возникать симптомы беспокойства и раздражительности.

Сообщение о предполагаемых побочных реакциях

Важно сообщать о предполагаемых нежелательных реакциях после регистрации лекарственного средства. Это позволяет осуществлять постоянный мониторинг соотношения польза/риск лекарственного средства.Медицинских работников просят сообщать о любых предполагаемых нежелательных реакциях через схему «Желтая карта» по адресу: www.mhra.gov.uk/yellowcard или выполнить поиск по запросу «Желтая карта MHRA» в Google Play или Apple App Store.

Парацетамол

У взрослых, принявших 10 г или более парацетамола, возможно поражение печени. Прием внутрь 5 г или более парацетамола может привести к повреждению печени, если у пациента есть факторы риска (см. ниже).

Факторы риска

Если пациент

a, Находится на длительном лечении карбамазепином, фенобарбиталом, фенитоином, примидоном, рифампицином, зверобоем или другими препаратами, индуцирующими ферменты печени.

или

b, Регулярно употребляет этанол в количествах, превышающих рекомендуемые.

или

c, Вероятно, истощение по глутатиону, т.е. расстройства пищевого поведения, муковисцидоз, ВИЧ-инфекция, голодание, кахексия.

Симптомы

Симптомами передозировки парацетамола в первые 24 часа являются бледность, тошнота, рвота, анорексия и боль в животе. Повреждение печени может стать очевидным через 12-48 часов после приема внутрь. Может наблюдаться повышение уровня печеночных трансаминаз, лактатдегидрогеназы и билирубина, а также повышение МНО.Возможны нарушения метаболизма глюкозы и метаболический ацидоз. При тяжелом отравлении печеночная недостаточность может прогрессировать до энцефалопатии, кровотечения, гипогликемии, гипокалиемии, отека мозга, желудочно-кишечного кровотечения и смерти. Острая почечная недостаточность с острым канальцевым некрозом, на которую указывают боль в пояснице, гематурия и протеинурия, может развиться даже при отсутствии тяжелого поражения печени. Сообщалось о сердечной аритмии, панкреатите и панцитопении.

Менеджмент

Немедленное лечение необходимо при передозировке парацетамола.Несмотря на отсутствие выраженных ранних симптомов, пациентов следует срочно направлять в стационар для оказания неотложной медицинской помощи. Симптомы могут ограничиваться тошнотой или рвотой и могут не отражать тяжести передозировки или риска повреждения органов. Управление должно осуществляться в соответствии с установленными рекомендациями по лечению, см. раздел о передозировке BNF.

Лечение активированным углем следует рассмотреть, если передозировка была принята в течение 1 часа. Концентрацию парацетамола в плазме следует измерять через 4 часа или позже после приема внутрь (более ранние концентрации ненадежны).Лечение N-ацетилцистеином можно проводить до 24 часов после приема парацетамола, однако максимальный защитный эффект достигается до 8 часов после приема. По прошествии этого времени эффективность антидота резко снижается. При необходимости пациенту следует ввести внутривенно N-ацетилцистеин в соответствии с установленной схемой дозирования. Если рвота не является проблемой, прием метионина внутрь может быть подходящей альтернативой в отдаленных районах вне больницы. Ведение пациентов с серьезной печеночной дисфункцией более чем через 24 часа после приема внутрь следует обсудить с NPIS или гепатологическим отделением.

Кодеин

Одновременное употребление алкоголя и психотропных препаратов потенцирует эффекты передозировки.

Симптомы передозировки кодеином могут включать:

▪ Угнетение центральной нервной системы (включая угнетение дыхания), но это вряд ли будет тяжелым, если передозировка не велика или не происходит одновременного приема с другими седативными средствами или алкоголем;

▪ зрачки точного размера;

▪ тошнота и рвота;

▪ гипотензия и тахикардия возможны, но маловероятны.

Менеджмент

Общие симптоматические и поддерживающие меры, включая очистку дыхательных путей и мониторинг показателей жизнедеятельности до стабилизации состояния. Рассмотрите возможность приема активированного угля, если взрослый обращается в течение 1 часа после приема более 350 мг или ребенок более 5 мг/кг. Дайте налоксон, если присутствует кома или угнетение дыхания. Налоксон является конкурентным антагонистом с коротким периодом полувыведения, поэтому у серьезно отравленных пациентов могут потребоваться большие и повторные дозы.Наблюдайте за пациентами в течение не менее 4 часов после приема внутрь.

Фармакотерапевтическая группа: кодеин и парацетамол

Код УВД: N02AJ06

Парацетамол обладает болеутоляющим и жаропонижающим действием, сходным с действием аспирина со слабым противовоспалительным действием. Парацетамол является лишь слабым ингибитором биосинтеза простагландинов, хотя есть некоторые свидетельства того, что он может быть более эффективным в отношении ферментов в ЦНС, чем в периферических. Этот факт может частично объяснить его хорошо задокументированную способность снижать лихорадку и вызывать анальгезию, эффекты, которые включают воздействие на нервные ткани.Однократный или повторный прием терапевтических доз парацетамола не оказывает влияния на сердечно-сосудистую и дыхательную системы. Кислотных изменений не происходит, раздражения, эрозии или кровотечения желудка не возникает, как это может произойти после приема салицилатов. Оказывает лишь слабое влияние на тромбоциты и не влияет на время кровотечения или выведение мочевой кислоты.

Кодеин — слабый анальгетик центрального действия. Кодеин оказывает свое действие через μ-опиоидные рецепторы, хотя кодеин имеет низкое сродство к этим рецепторам, а его обезболивающее действие обусловлено его превращением в морфин.Основное влияние оказывает на ЦНС и кишечник. Эффекты чрезвычайно разнообразны и включают обезболивание, сонливость, изменения настроения, угнетение дыхания, снижение перистальтики желудочно-кишечного тракта, тошноту, рвоту и изменения эндокринной и вегетативной нервной систем. Облегчение боли является относительно избирательным, поскольку другие сенсорные модальности (осязание, вибрация, зрение, слух и т. д.) не навязываются. Было показано, что кодеин, особенно в сочетании с другими анальгетиками, такими как парацетамол, эффективен при острой ноцицептивной боли.

Парацетамол легко всасывается из желудочно-кишечного тракта, максимальная концентрация в плазме крови достигается через 30-2 часа после приема внутрь. Метаболизируется в печени и выводится с мочой в основном в виде глюкуронидных и сульфатных конъюгатов. Менее 5% выводится в виде неизмененного парацетамола. Период полувыведения варьирует примерно от 1 до 4 часов. Связывание с белками плазмы незначительно при обычных терапевтических концентрациях, но увеличивается с повышением концентрации.

Минорный гидроксилированный метаболит, который обычно продуцируется в очень небольших количествах оксидазами со смешанной функцией в печени и который обычно детоксицируется путем конъюгации с глутатионом печени, может накапливаться после передозировки парацетамола и вызывать повреждение печени.

Кодеин и его соли всасываются из желудочно-кишечного тракта. Прием кодеина фосфата приводит к пиковой концентрации кодеина в плазме примерно через час. Кодеин метаболизируется путем O- и N-деметилирования в печени до морфина и норкодеина.Кодеин и его метаболиты почти полностью выводятся почками, в основном в виде конъюгатов с глюкуроновой кислотой. Сообщалось, что период полувыведения из плазмы составляет от 3 до 4 часов после перорального или внутрисосудистого введения.

Традиционные исследования с использованием принятых в настоящее время стандартов для оценки токсичности парацетамола для репродукции и развития недоступны.

Прежелатинизированный крахмал

Стеарат кальция

Докузат натрия с бензоатом натрия (Е211)

Метабисульфит натрия (Е223)

Оболочка капсулы:

Желатин

Диоксид титана (Е171)

Эритрозин (Е127)

Индигокармин (Е132)

Типографская краска:

Шеллак

Пропиленгликоль

Гидроксид аммония

Оксид железа черный (Е172)

Хранить при температуре не выше 25°C.Держите контейнер во внешней коробке.

Блистерные полоски из ПВХ/алюминиевой фольги, содержащие 1×7, 2×7, 4×7, 1×8, 3×8, 50×6, 100×6, 5×20, 10×10 капсул.

Не все размеры упаковки могут продаваться.

ЮКБ Фарма Лтд

208 Бат Роуд

Слау

Беркшир SL1 3WE

Соединенное Королевство

Идентификация генных сетей, связанных с противолейкемическим действием противовоспалительных препаратов на клеточные линии острого миелоидного лейкоза

Введение

Несмотря на последние достижения в терапии, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) остается медицинской проблемой с высокими показателями заболеваемости и смертности .Для большинства пациентов аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток остается единственным вариантом лечения, но из-за преклонного возраста при постановке диагноза значительная часть пациентов не подходит для этой формы терапии. Тем не менее, новые методы лечения оправданы. Имеются доклинические данные о том, что противовоспалительные соединения, такие как ингибиторы ЦОГ-2 и стероиды, могут обладать противоопухолевой активностью при различных типах опухолей, включая ОМЛ; тем не менее механизмы, связанные с его противоопухолевой активностью, не ясны.Таким образом, целью данной работы было оценить противолейкемический эффект противовоспалительных соединений нимесулида и преднизолона в клеточных линиях ОМЛ и идентифицировать гены и молекулярные пути, связанные с цитотоксичностью, с помощью анализа транскриптома.

Методы

Линии лейкемических клеток HL-60, THP-1, OCI-AML2 и OCI-AML3 обрабатывали нимесулидом и преднизолоном в дозе 100 мкМ по отдельности и в комбинации, а также цитарабином в концентрации 2,5 мкМ. Через двадцать четыре часа после обработки мы измерили количество погибших клеток с использованием набора для обнаружения апоптоза аннексина V FITC (ThermoFisher) и проанализировали клеточный цикл после фиксации клеток 70% спиртом и инкубации с йодидом пропидия (1 мг/мл) и РНКазой. 10 мг/мл).В другом эксперименте мы собирали клетки после 4 часов обработки для анализа транскриптома. РНК экстрагировали из контрольной (ДМСО) и экспериментальной групп (1 — нимесулид, 2 — преднизолон, 3 — нимесулид и преднизолон) с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Набор Illumina® NEBNext® Ultra II Directional RNA Library Prep Kit использовали для подготовки библиотеки в соответствии с протоколом производителя с использованием модуля магнитной изоляции Poly(A) mRNA. Эквимолярное количество библиотек секвенировали с использованием Illumina NextSeq 500, следуя инструкциям производителя, на Genomics Core Оклахомского медицинского исследовательского фонда (США).Последовательности, полученные с помощью метода RNA-Seq, были сопоставлены с геномом человека эталона GRCh47.75 с помощью программного обеспечения Spliced ​​Transcripts Alignment to a Reference (STAR) v2.5, а для получения нормализованных значений в FPKM — с помощью программного обеспечения Expectation-Maximization (RSEM). ) использовалась версия 1.3.0. Для выявления сети генов, коррелирующих с лечением (модулей), мы использовали анализ взвешенной корреляционной сети (WGCNA). Анализ функционального обогащения дифференциально выраженных модулей WGCNA был выполнен с использованием интегрированной базы данных аннотаций, визуализации и обнаружения (DAVID) v6.8, чтобы соотнести с биологическими процессами.

Результаты

При анализе клеточного цикла мы наблюдали значительное увеличение (p < 0,05) в фазе суб-G0 (гибель клеток) после лечения только нимесулидом и в комбинации с преднизолоном (рис. 1). В группе, принимавшей только преднизолон, эффекта не наблюдалось. Эффект клеточного цикла, индуцированный нимесулидом на HL-60 и OCI-AML2, был аналогичен эффекту, индуцированному цитарабином, стандартным химиотерапевтическим агентом для ОМЛ, который, как известно, вызывает остановку в S-фазе.Кроме того, остановка клеточной линии в THP-1 была более выраженной при применении нимесулида, чем при применении цитарабина, в то время как OCI-AML3 был менее чувствителен как к нимесулиду, так и к цитарабину. Что касается механизма гибели клеток, лечение нимесулидом индуцировало преимущественно усиление позднего апоптоза, которое усиливалось после комбинированного лечения нимесулидом и цитарабином (рис. 2). После демонстрации остановки клеточного цикла и индукции апоптоза после лечения нимесулидом мы провели полное секвенирование транскриптома с последующим анализом WGCNA.Мы идентифицировали генные модули, которые в значительной степени коррелировали с противовоспалительным лечением: 1 модуль с пониженной регуляцией (светло-желтый с p = 0,00052) и 2 модуля с повышенной регуляцией (светло-голубой с p = 0,00025 и желто-коричневый с p = 0,000038). Анализ функционального обогащения с использованием DAVID показал активацию генных сетей, связанных с процессами апоптоза и аутофагии, и негативную регуляцию генных сетей, связанных с клеточным циклом и путями сплайсинга РНК

Выводы

Ингибитор ЦОГ-2 нимесулид вызывал остановку апоптоз в клеточных линиях ОМЛ и потенцировало цитотоксические эффекты цитарабина.Это лечение было связано с усилением регуляции аутофагии и апоптоза и подавлением клеточного цикла и генных сетей сплайсинга РНК.

  1. Скачать: Скачать изображение High-res (164 КБ)
  2. Скачать: Скачать полноразмерное изображение

Рисунок 1.

Раскрытие 1.

Разгласование

Santos: 5 Novartis: Членство в Совете директоров организации или консультативные комитеты, финансирование исследований; Amgen: Членство в совете директоров или консультативных комитетах организации; Аббви: Членство в совете директоров или консультативных комитетах организации; Pfizer: Консультирование, членство в совете директоров или консультативных комитетах организации.