Электрофорез сделать: Электроформез в Москве, цены за сеанс

Содержание

Электрофорез. Где пройти лечение электрофорезом в Москве

Электрофорез

АО Семейный доктор – Электрофорез.Электрофорез – это физиотерапевтическая процедура, обеспечивающая лечебный эффект с помощью сочетания локального воздействия постоянного электрического тока и лекарственных препаратов, вводимых при помощи тока. Под воздействием электрического поля лекарство в виде заряженных частиц (ионов) проникает в кожу через устья сальных и потовых желёз, волосяные фолликулы и межклеточные промежутки. Основная часть введенного лекарства остаётся в области, подвергаемой воздействию, некоторая часть с током крови и лимфы разносится по всему организму.

Электрофорез имеет широкую сферу применения. С помощью электрофореза может вводиться достаточно широкий перечень лекарственных препаратов. Данный вид физиотерапии используется в лечении многих заболеваний. Обычно курс состоит из 10 сеансов электрофореза, проводимых ежедневно или через день.

Продолжительность одного сеанса – 10-15 минут.

Если вы ищете, где пройти лечение электрофорезом в Москве, обратитесь в АО «Семейный доктор». Оплатив весь курс процедур сразу, вы получаете скидку на последнюю процедуру. При единовременной оплате 5-ти процедур скидка на последнюю составит 50%, при оплате 7-ми – 70%. При оплате 10-ти процедур электрофореза последняя будет для вас бесплатной

Ниже вы можете уточнить стоимость лечения электрофорезом (цену процедуры), а также выбрать поликлинику, находящуюся в наиболее удобном для вас районе Москвы. 

Уважаемые пациенты!
Обращаем ваше внимание, что указанные цены не являются окончательной стоимостью приёма.
Если манипуляция оказывается на приёме врача, то к стоимости манипуляции добавляется стоимость приёма (соответственно, стоимость приёма увеличивается на стоимость выполненных манипуляций).

Электрофорез для детей на воротниковой зоне, также проведения электрофорез для грудничков в Евромед

Проведение лечебных процедур электрофорезом в Омске. Электрофорез – метод введения лечебных препаратов через кожный покров, под действием электрического поля. При этом лекарство вводится в наиболее химически активной форме.

  • Консультация
  • Диагностика
  • Лечение

Электрофорез – это метод введения лекарственного вещества под действием электрического поля в организм. Лечение электрофорезом проводится как через кожные покровы (в неврологии, травматологии и др.), так и через слизистые оболочки (в стоматологии, оториноларингологии, гинекологии и др.). Вещество вводится непосредственно в очаг воспаления в малых, но достаточно эффективных дозах, накапливаясь в тканях и действуя продолжительное время.

Поэтому особенно актуален электрофорез для детей, т.к. дает возможность местно использовать лекарства, которые в раннем детском возрасте нельзя применять другими способами. При этом лекарство вводится в наиболее химически активной форме — в виде ионов – и не разрушается, как например, при введении через рот. При проведении электрофореза электрический ток благоприятно влияет на реактивность и иммунобиологический статус тканей.

Этот метод применяется применяется с самого раннего возраста – например, электрофорез для грудничков используется уже спустя 3-6 недель после рождения. Для детей до года при этой процедуре в качестве лекарственного вещества часто используется эуфиллин как средство, снимающее тонус гладкой мускулатуры и улучшающее кровообращение (в основном, проводится электрофорез на воротниковую зону).

В целом выбор зоны проведения электрофорез зависит от заболевания: так, электрофорез воротниковой зоны проводится при заболеваниях нервной или сосудистой системы, электрофорез конечностей – при заболеваниях суставов, электрофорез поясничной зоны – при гинекологических заболеваниях и т.п.

Вернуться на страницу:


Остались вопросы?

 

в каких случаях назначают электрофорез, противопоказания, где сделать электрофорез| Юнимед

Запись на прием Вызов врача на дом Заказать звонок

Электрофорез

Электрофорез — это физиотерапевтическая процедура, которая предполагает введение лекарственных препаратов через кожу и слизистые оболочки с помощью слабых электрических импульсов. Ток подаётся через специальный прибор и преобразуется в частицы с положительным или отрицательным зарядом.

Сам процесс гальванизации (воздействия током) безболезненный и не повреждает кожные покровы. Пациент чувствует лишь незначительные покалывания там, где закреплены электроды.

Терапевтический эффект, как правило, достигается благодаря курсовому лечению. В зависимости от заболевания и степени его тяжести, врач назначает необходимое количество сеансов. Длительность каждого — от 10 до 40 минут.

В каких случаях назначают электрофорез

Электрофорез используют для лечения заболеваний из разных медицинских сфер: оториноларингологии, офтальмологии, стоматологии, гастроэнтерологии и других. Например, он эффективен при:

  • насморке, синусите, тонзиллите, бронхите;
  • блефарите и кератите;
  • пародонтите и стоматите;
  • язве, гастрите и панкреатите;
  • цистите, пиелонефрите и вагините;
  • заболеваниях нервной системы;
  • ожогах, дерматите и акне;
  • артрите, артрозе, остеохондрозе и пр.

Преимущества электрофореза

Как метод лечения электрофорез используется в физиотерапии довольно давно, но остаётся востребованным, несмотря на появление более современных технологий. Всё благодаря следующим достоинствам:

  • медикаменты вводятся именно в ту область, где имеется патология, что обеспечивает быстрый эффект;
  • благодаря регулярным сеансам активное вещество препарата достигает оптимальной концентрации в организме, поэтому действует дольше;
  • лекарство поступает прямо в поражённую область, минуя кровь, лимфу и другие среды организма;
  • процедура не требует предварительной подготовки.

Противопоказания

Несмотря на общую безопасность, существует ряд ограничений, при которых от электрофореза стоит отказаться:

  • индивидуальная непереносимость препаратов и электрического тока;
  • открытые раны в местах, где необходимо установить электроды;
  • стадия обострения заболевания;
  • наличие онкологических заболеваний;
  • активная форма туберкулёза;
  • высокая температура;
  • тяжёлая форма психических заболеваний;
  • ношение кардиостимулятора или металлических зубных протезов.

Прежде чем назначать электрофорез, врач обязан изучить историю болезни и убедиться, что эти противопоказания отсутствуют у пациента.

Процедура также НЕ проводится при менструации!

Где сделать электрофорез

Электрофорез в Ижевске предлагает многопрофильная клиника «Юнимед». Опытные врачи, приятная обстановка и современное оборудование — гарант положительного эффекта от сеансов.

Чтобы записаться или задать интересующие вопросы звоните по одному из телефонов, указанных в разделе «Контакты». Администратор сориентирует по ценам и предложит удобное время для посещения.

Я ничего не могу с собой сделать, аккорды для гитары

Am           D
Сияет небо, свет сквозь оспу звезд
C                  G
Как вспышка гнева, я в своем доме гость
Am           D
Я ничего не могу с собою сделать
C                  
G
Я ничего не могу с собою сделать Am D Разбитой вазой я упал на пол C G Как в старой сказке, я не знал, кто волк Am D Я ничего не могу с собою сделать C G Я ничего не могу с собою сделать [Бридж] Am Dm Я целую тело Синяки и вены C G Плечи в веснушках и Контур обкусанных губ Am Dm Целую тело Синяки и вены C G Плечи в веснушках и Губы обкусаны [Припев] Am G Я запомнил сон, где мы вдвоем F Пытали день, морили ночь E Пускали кровь своей мечте Am Она не сохла на ноже Am G Я запомнил сон, где мы вдвоем F Пытали день, морили ночь E Пускали кровь своей мечте
Am
Она не сохла на ноже Am D Твой стиль одежды — как на встречу вдов C G И улыбаться через скрип зубов Am D Я ничего не могу с собою сделать C G Я ничего не могу с собою сделать Am D Теперь не мил мне блеск янтарных глаз C G Со мной быть просто, но не в этот раз Am D Я ничего не могу с собою сделать C G Я ничего не могу [Припев] Am G Я запомнил сон, где мы вдвоем F Пытали день, морили ночь E Пускали кровь своей мечте Am Она не сохла на ноже Am G Я запомнил сон, где мы вдвоем F Пытали день, морили ночь E Пускали кровь своей мечте
Am
Она не сохла на ноже Am D Сияет небо, свет сквозь оспу звезд C G Как вспышка гнева, я в своем доме гость Am D Я ничего не могу с тобою сделать C G Я ничего не могу с тобою сделать

Электрофорез дома, собран из чего было.

.. – Законченные проекты

В связи с проблемами со спиной решил пройти курс электрофореза. Так как 3 курса по 30 процедур в поликлинике просто нереально, решил сделать сам себе.

Порывшись в барахле, был найден трансформатор 5Вт 220/2х20В, старый миллиамперметр от неизвестного уже оборудования (шкала на 300 мА), и всякая валявшаяся в соответствующем ящике электронная мелочевка.

В результате появилась вот эта коробочка. На нагрузке 2 Ком (таково сопротивление моей тушки при конкретных условиях фореза) коробочка способна обеспечить до 25мА постоянного тока. Изготовлены простенькое шасси и корпус без претензий.

Большой проблемой оказались прокладки. Свинцовые пластинки куда-то были засунуты при переезде и не найдены, поэтому родились новые электроды (в физиокабинетах не встречающиеся).

Электрод сделан из мелкой сетки, нержавеющая сталь. Вырезано из сетки два прямоугольника 120х170, 10 мм “поля” загнуты от края, таким образом сетка стала размером 100х150 и не колется. Дополнительно из тряпки (старого х/б пододеяльника) сшиты чехольчики на электроды.

Прокладки сшиты из того же пододеяльника, 2 слоя ткани, 4 слоя марлевого бинта, 2 слоя ткани. Чем толще прокладка, тем комфортнее форез, и тем больше надо разводить препараты. Указанная толщина компромиссная, в поликлинике прокладки обычно намного толще.

Два мешка с песком для придавливания электродов сшиты из тонкого брезента, при работе заворачиваются в обычные полиэтиленовые пакеты. На фото их нет. Размер – со школьную тетрадь. Тяжеленькие.

 

Комментарий к схемотехнике: наверное, надо было делать регулятор тока, но я сделал регулятор напряжения. Цепочка резисторов с потенциометром посередине определяет дипазон регулировки и соответствие ее шкале стрелочного прибора. Резистор, шунтирующий стрелочный прибор (шунт) рассчитан, чтобы полное отклонение стрелки было на 30 мА.

 

Хотел добавить еще благодарности коллегам Gideon и ДимЛерич за поддержку и консультации, а Gideon-у еще и за аккуратно выполненную схему по мотивам моего эскиза.

Изменено пользователем Dok

Электрофорез гемоглобина для диагностики гемоглобинопатий

Электрофорез гемоглобина в щелочном геле позволяет определить процентное содержание основных изоформ гемоглобина и провести скрининг гемоглобинопатий. В норме в крови взрослого человека не менее 96,5 % гемоглобина представлено изоформой HbA, которая состоит из двух пар полипептидных цепей (глобинов): 2α и 2β, каждая из которых связана с гемом. Гемоглобинопатии связаны с наличием аномального варианта гемоглобина. Посредством электрофореза гемоглобина можно проводить скрининг состояний, связанных со структурными аномалиями гемоглобина. При этом метод не позволяет установить тип и характер гемоглобинопатии.

Синонимы английские

Serum Hemoglobin Electrophoresis.

Метод исследования

Электрофорез и денситометрия.

Единицы измерения

Мг/дл (миллиграмм на децилитр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

  • Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Электрофорез гемоглобина в щелочном геле позволяет определить процентное содержание основных изоформ гемоглобина и провести скрининг гемоглобинопатий. В норме в крови взрослого человека не менее 96,5 % гемоглобина представлено изоформой HbA, которая состоит из двух пар полипептидных цепей (глобинов) – 2α и 2β, – каждая из которых связана с гемом. HbA обеспечивает адекватный газообмен и тканевую оксигенацию. Фракция HbA2 – второстепенная форма гемоглобина, имеет формулу 2α2δ. Также у взрослого допустимо наличие следовых количеств фетального гемоглобина HbF (2α2γ), который является преобладающей фракцией в течение внутриутробного периода. В течение первых 6 месяцев жизни HbF замещается HbA.

Нарушения структуры гемоглобина обычно разделяют на две группы: гемоглобинопатии и талассемии, хотя талассемии являются формой гемоглобинопатии. Талассемии представляют собой нарушения синтеза α-, β- или обеих цепей гемоглобина. Также могут отмечаться нарушения синтеза δ-, γ- цепей. Большинство вариантов α- и β-талассемий сопровождается изменением уровня HbF и HbA2, поэтому определение этих изоформ может быть использовано для скрининга этих состояний.

Остальные гемоглобинопатии связаны с наличием аномального варианта гемоглобина. Наиболее распространённые и клинически значимые аномальные варианты гемоглобина: S, D, E, C. Варианты HbS и HbD  – патологические формы гемоглобина, которые обладают идентичной миграцией в щелочном геле и являются результатом точечных мутаций гена, кодирующего β-глобин. Варианты Е и С при данном методе мигрируют в составе фракции HbA2, при их наличии фракция HbA2 достигает более 25 %. Наибольшее клиническое значение представляет HbS-вариант, который приводит к серповидноклеточной анемии.

Электрофорез гемоглобина в щелочном геле позволяет проводить скрининг состояний, связанных со структурными аномалиями гемоглобина. При этом метод не позволяет установить тип и характер гемоглобинопатии.

Электрофорез является чувствительным методом, с помощью которого можно исключить гемоглобинопатии либо определить тактику дальнейшего обследования для установления точного диагноза заболевания. Метод характеризуется высокой внутрипостановочной (SD

Метод исследования основан на электрофорезе гемоглобина, полученного при лизисе отмытых эритроцитов обследуемого. После разделения гемоглобина на фракции производится окрашивание зон миграции. Содержание гемоглобина в составе фракций измеряется с помощью цифровой денситометрии.

Когда назначается исследование?

  • Скрининг гемоглобинопатий;
  • наличие семейного анамнеза гемоглобинопатий, планирование семьи;
  • микроцитарная анемия, не связанная с дефицитом железа;
  • гемолитическая анемия неустановленной этиологии;
  • обнаружение изменённых эритроцитов (серповидная деформация) при микроскопическом исследовании крови.

Что означают результаты?

Референсные значения

Компонент

Возраст

Референсные значения, %

Гемоглобин HbA

5,9 – 77,2

1 – 3 мес.

7,9 – 92,4

3 – 6 мес.

54,7 – 97,1

6 – 9 мес.

80,0 – 98,0

9 – 13 мес.

86,2 – 98,0

13 – 24 мес.

88,8 – 98,0

> 2 лет

≥ 96,50

Гемоглобин HbA2

0,0 – 2,1

1 – 3 мес.

0,0 – 2,6

3 – 6 мес.

1,3 – 3,1

6 – 24 мес.

2,0 – 3,3

> 2 лет

≤ 3,5

Гемоглобин HbF

22,8 – 92,0

1 – 3 мес.

7,6 – 89,8

3 – 6 мес.

1,6 – 42,2

6 – 9 мес.

0,0 – 16,7

9 – 13 мес.

0,0 – 10,5

13 – 18 мес.

0,0 – 7,9

18 – 24 мес.

0,0 – 6,3

> 2 лет

Аномальные варианты гемоглобина

 

Не обнаружены

Заключение

 

Уровень HbA, HbA2, HbF cоответствует возрастным нормам, патологические формы гемоглобина не выявлены

Демодекоз: лечение, причины, симптомы, признаки, фото, цены

Трихолог, дерматолог, врач высшей категории

Московский проспект, д. 143

Онколог-дерматолог, врач высшей категории

Гражданский проспект, д.107, к.4

Онколог-дерматолог, врач высшей категории

Гражданский проспект, д.107, к.4

Коломяжский проспект, д. 20

Дерматолог, специалист лазерных технологий в онкодерматологии, врач высшей категории

Коломяжский проспект, д. 20

Дерматолог, специалист лазерных технологий в онкодерматологии, врач высшей категории

Московский проспект, д. 143

Дерматолог, специалист лазерных технологий в онкодерматологии

Московский проспект, д. 143

Гражданский проспект, д.107, к.4

Коломяжский проспект, д. 20

Дерматовенеролог, трихолог, косметолог, специалист лазерных технологий

Московский проспект, д. 143

Гражданский проспект, д.107, к.4

Коломяжский проспект, д. 20

Врач дерматовенеролог, трихолог, косметолог. Высшая квалификационная категория.

Московский проспект, д. 143

Дерматолог, косметолог, Специалист лазерных технологий в онкодерматологии

Коломяжский проспект, д. 20

Дерматовенеролог, специалист лазерных технологий в онкодерматологии

Московский проспект, д. 143

Коломяжский проспект, д. 20

дерматолог, косметолог, специалист лазерных технологий

Гражданский проспект, д. 107, к.4

Дерматовенеролог, доктор медицинских наук, профессор

Московский проспект, д. 143

Дерматовенеролог, специалист лазерных технологий в онкодерматологии

Гражданский проспект, д.107, к.4

Онколог-дерматолог, кандидат медицинских наук

Московский проспект, д. 143

Гражданский проспект, д.107, к.4

Коломяжский проспект, д. 20

Электрофорез – обзор | ScienceDirect Topics

Электрофорез

Современное понимание белкового состава сыворотки и плазмы основано на методах электрофореза, введенных Тизелиусом. Геразделенные белки растворяли в растворе электролита при пропускании электрического тока через U-образную кварцевую трубку, в которой находился раствор белка. При рН 7,6 четыре фракции сывороточного белка, обозначенные как альбумин, α, β и γ, идентифицировали и количественно определяли оптически по изменению показателя преломления на границах между этими полосами.Поскольку разделение было достигнуто в однородном растворе без твердой поддерживающей среды, конвективные силы препятствовали разделению на отдельные зоны. Следовательно, этот метод был назван подвижной границей или фронтальным электрофорезом . Введение фильтровальной бумаги в качестве поддерживающей антиконвекционной среды позволило разделить белковые фракции на дискретные полосы или зоны в процессе, названном зональным электрофорезом . На твердой подложке и при рН 8,6 α-фракция далее распадается на две группы белков: α 1 и α 2 .Использовались и другие поддерживающие среды, такие как мембрана из ацетата целлюлозы, гель агарозы, крахмальный гель и полиакриламидный гель. Ацетат целлюлозы и агароза преобладали в клинической лаборатории из-за простоты использования, низкой стоимости и коммерческой доступности (Jeppsson et al., 1979).

Нанесение образцов можно проводить в лунки, прорезанные в геле, но этот процесс обычно оставляет артефакты, которые могут мешать сканированию. Метод решения этой проблемы заключается в погружении образца в гель с помощью лежащего поверх шаблона. Затем каждый конец геля погружают в отдельные буферные камеры, в которых устанавливаются электроды. Между электродами подается напряжение, генерирующее ток, который проходит через гель, обычно в течение примерно 30 минут, для достижения желаемого разрешения. Ионная сила буфера определяет величину тока и движение белков при фиксированном напряжении. Если ионная сила низкая, заряженные белки переносят относительно больший ток. Если ионная сила высока, белки переносят меньший ток и перемещаются на меньшее расстояние.Если электроды не выровнены должным образом, ток может быть более плотным на одной стороне геля, чем на другой; белки будут мигрировать дальше в сторону с большим током. Если электрофорез продолжается слишком долго, белки могут мигрировать из геля в буфер. Если в электрической цепи есть разрыв и ток не проходит, белки не будут двигаться от точки приложения. Часто гели демонстрируют «артефакт улыбки», при котором образцы в центре геля мигрируют дальше, чем образцы по краям.

После электрофореза гель обрабатывают мягким фиксатором, например уксусной кислотой, который осаждает белки в тех местах, куда они мигрировали. Затем их окрашивают, а гель сушат и очищают от излишков красителя. Образцы белков можно проверить визуально для качественной идентификации аномальных белков. Денситометрические сканеры используются для создания кривых и для количественного определения относительного процентного содержания белка в каждой фракции. Затем эти проценты умножаются на общий белок (измеренный отдельно) в образце, чтобы получить концентрацию белка в каждой фракции.

Что такое «гель-электрофорез» и почему он так важен для тестирования ДНК в уголовных делах?

Эрик Фэйрфилд — частный исследователь, использующий гель-электрофорез для разделение молекул ДНК; он получил награду R&D за изобретение нового метод гель-электрофореза. Он отвечает:

«ДНК — это заряженная молекула. ​​Следовательно, молекулы ДНК будут двигаться, когда электрическое поле приложено к жидкости, в которой они растворены. Если жидкость простая, например, вода с небольшим количеством солей в ней, вся ДНК молекулы движутся почти с одинаковой скоростью. В таких условиях трудно различать крошечные несоответствия в движении различных видов ДНК.

“Если раствор сделать менее жидким, как в геле, и молекулы ДНК все начать движение по раствору с некоторого начального небольшого объема, т. е. с по существу, одна и та же исходная точка — тогда молекулы могут двигаться с заметной скоростью. разные скорости. Обычно более мелкие молекулы ДНК движутся быстрее, чем более крупные. Через некоторое время молекулы разделяются по размеру.Если молекулы попадут в только несколько осторожных размеров, тогда полосы (маленькие прямоугольники) ДНК появятся в гель. Каждая из этих полос содержит нити ДНК определенного размера».

[Примечание редактора: ДНК дактилоскопия использует гель-электрофорез, чтобы различить образцы генетический материал. Молекулы ДНК человека обрабатывают ферментами, которые их расщепляют в определенных характерных точках, тем самым сводя ДНК к набору кусочки более удобного размера.Фрагменты ДНК загружают в гель и помещают в электрическом поле, которое электрофоретически сортирует фрагменты ДНК на различные банды. Эти полосы можно окрасить радиоактивным красителем, чтобы сделать их видны для методов визуализации.]

«Для отдельных людей полосы ДНК, созданные в результате этого процесса, будут имеют индивидуальную структуру. Часть этого шаблона приходит от размера ДНК; часть его исходит из последовательности ДНК конкретный размер.

“В криминалистике подозреваемые могут быть устранены, если их структура ДНК не соответствует структуре ДНК молекулы, обнаруженные на месте преступления. Другие люди могут стать подозреваемыми, если их образец ДНК совпадает с образцом человека, совершившего преступление и если образец ДНК подозреваемого не очень распространен. Идея «не очень Общим» является то, что ДНК, по сути, говорит: «Это преступление было совершено человеком ростом 6 футов 2 дюйма». белый мужчина со шрамом на левом запястье пошел к У.C.L.A., водит красный 1992 спортивный автомобиль, зарабатывает 62 000 долларов в год и в 1978 году был диск-жокеем». Хотя может быть более одного такого человека, маловероятно, что более одного из них были в место преступления одновременно.

Что включает в себя гель-электрофорез?

Гель-электрофорез широко используется в лабораториях медико-биологических наук для разделения макромолекул, таких как ДНК, РНК и белки. В этом методе молекулы разделяются в зависимости от их размера и электрического заряда.Гель-электрофорез обычно проводится в лабораториях для анализа образцов ДНК, РНК или белков из различных источников.

Загрузка образцов ДНК в агарозный гель для электрофореза — Авторские права на изображение: science photo, ID изображения: 214331152 через Shutterstock.com

Принципы гель-электрофореза

Метод гель-электрофореза использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, наносят на пористый гель, помещенный в ионную буферную среду.При приложении электрического заряда каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет двигаться через гель с разной скоростью.

Пористый гель, используемый в этом методе, действует как молекулярное сито, которое отделяет более крупные молекулы от более мелких. Молекулы меньшего размера быстрее перемещаются по гелю, в то время как более крупные остаются позади. Подвижность частиц также контролируется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, притягивают к себе молекулы на основе их заряда.

Лаборатория гель-электрофореза ДНК Play

Как это работает?

Гель, используемый в гель-электрофорезе, обычно состоит из материала, называемого агарозой, который представляет собой желеобразное вещество, извлеченное из морских водорослей. Этот пористый гель можно использовать для разделения макромолекул самых разных размеров. Гель погружают в солевой буферный раствор в камере для электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЕ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция заключается в контроле pH системы.Камера имеет два электрода — положительный и отрицательный — на двух концах.

Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружаются в крошечные лунки в геле с помощью пипетки. После завершения загрузки подается электрический ток напряжением 50–150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.

Скорость, с которой каждая молекула проходит через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее суммарным зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы бегут быстрее, оставляя позади более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большой размер уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.

После завершения разделения гель окрашивают красителем для выявления полос разделения. Бромид этидия представляет собой флуоресцентный краситель, обычно используемый в гель-электрофорезе. Гель замачивают в разбавленном растворе бромистого этидия, а затем помещают в УФ-трансиллюминатор для визуализации разделительных полос.

Полосы немедленно исследуются или фотографируются для использования в будущем, так как со временем они диффундируют в гель. Краситель также можно загрузить в гель заблаговременно, чтобы отслеживать миграцию молекул по мере ее возникновения.

Применение гель-электрофореза

Гель-электрофорез широко используется в лабораториях молекулярной биологии и биохимии в таких областях, как судебная медицина, природоохранная биология и медицина.

Ниже перечислены некоторые ключевые области применения этого метода:

  • При разделении фрагментов ДНК для дактилоскопии ДНК при исследовании мест преступлений
  • Для анализа результатов полимеразной цепной реакции
  • Для анализа генов, связанных с конкретным заболеванием
  • В профилировании ДНК для таксономических исследований с целью различения разных видов
  • При тестировании на отцовство с использованием ДНК-дактилоскопии
  • При изучении структуры и функции белков
  • При анализе устойчивости к антибиотикам
  • В методах блоттинга для анализа макромолекул
  • При изучении эволюционных взаимоотношений путем анализа генетического сходства между популяциями или видами

Молекулярная биология Игра

Ссылки

Дополнительная литература

Электрофорез в агарозном геле для разделения фрагментов ДНК.

Агароза выделена из водорослей родов Gelidium и Gracilaria и состоит из повторяющихся агаробиозных (L- и D-галактозных) субъединиц 2 . Во время гелеобразования полимеры агарозы связываются нековалентно и образуют сеть пучков, размеры пор которых определяют свойства геля для молекулярного сита. Использование электрофореза в агарозном геле произвело революцию в разделении ДНК. До внедрения агарозных гелей ДНК в основном разделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, что давало только приблизительный размер.Чтобы разделить ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле, ДНК загружают в заранее подготовленные лунки в геле и подают ток. Фосфатный остов молекулы ДНК (и РНК) заряжен отрицательно, поэтому при помещении в электрическое поле фрагменты ДНК будут мигрировать к положительно заряженному аноду. Поскольку ДНК имеет однородное соотношение массы и заряда, молекулы ДНК разделены по размеру в агарозном геле таким образом, что пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму ее молекулярной массы 3 . Ведущей моделью движения ДНК через агарозный гель является «предвзятая рептация», при которой передний край движется вперед и тянет остальную часть молекулы вдоль 4 . Скорость миграции молекулы ДНК через гель определяется: 1) размером молекулы ДНК; 2) концентрация агарозы; 3) конформация ДНК 5 ; 4) приложенное напряжение, 5) присутствие бромистого этидия, 6) тип агарозы и 7) буфер для электрофореза. После разделения молекулы ДНК можно визуализировать в ультрафиолетовом свете после окрашивания соответствующим красителем.Следуя этому протоколу, учащиеся должны быть в состоянии: 1. Понять механизм разделения фрагментов ДНК в гелевой матрице 2. Понять, как конформация молекулы ДНК будет определять ее подвижность через гелевую матрицу 3. Идентифицировать агарозный раствор соответствующую концентрацию для их нужд 4. Подготовьте агарозный гель для электрофореза образцов ДНК 5. Настройте аппарат для гель-электрофореза и источник питания 6. Выберите соответствующее напряжение для разделения фрагментов ДНК 7. Понять механизм, с помощью которого бромид этидия позволяет визуализировать полосы ДНК. 8. ​​Определить размеры разделенных фрагментов ДНК. Приготовление геля
  1. Отвесить соответствующую массу агарозы в колбу Эрленмейера. Агарозные гели готовят с использованием процентного раствора мас./об. Концентрация агарозы в геле будет зависеть от размеров фрагментов ДНК, которые нужно разделить, причем большинство гелей находится в диапазоне от 0.5%-2%. Объем буфера не должен превышать 1/3 объема колбы.

  2. Добавьте рабочий буфер в колбу с агарозой. Встряхните, чтобы перемешать. Наиболее распространенными буферами для протекания геля являются ТАЕ (40 мМ трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА) и ТВЕ (45 мМ трис-борат, 1 мМ ЭДТА).

  3. Растопить смесь агарозы/буфера. Чаще всего это делается путем нагревания в микроволновой печи, но также можно сделать над пламенем Бунзена. С интервалами в 30 с извлекайте колбу и взбалтывайте содержимое, чтобы хорошо перемешать.Повторяйте до тех пор, пока агароза полностью не растворится.

  4. Добавить бромид этидия (EtBr) до концентрации 0,5 мкг/мл. В качестве альтернативы гель также может быть окрашен после электрофореза в рабочем буфере, содержащем 0,5 мкг/мл EtBr, в течение 15–30 мин с последующим обесцвечиванием в рабочем буфере в течение такого же периода времени.

Примечание: EtBr предположительно является канцерогеном и должен быть утилизирован надлежащим образом в соответствии с правилами учреждения. При работе с гелями, содержащими EtBr, всегда следует надевать перчатки.Доступны альтернативные красители для окрашивания ДНК; однако EtBr остается самым популярным из-за его чувствительности и стоимости.

  1. Дайте агарозе остыть на столе или инкубируйте на водяной бане при 65 °C. Невыполнение этого требования приведет к деформации лотка для геля.

  2. Поместите лоток с гелем в устройство для литья. В качестве альтернативы можно также заклеить открытые края лотка для геля, чтобы создать форму. Поместите соответствующую расческу в форму для геля, чтобы создать лунки.

  3. Залейте расплавленную агарозу в форму для геля. Разрешить агарозы установить при комнатной температуре. Снимите расческу и поместите гель в коробку для геля. В качестве альтернативы гель можно завернуть в пищевую пленку и хранить при температуре 4 °C до использования ( рис. 1 ).

2. Установка гелевого аппарата и разделение фрагментов ДНК

  1. Добавьте загрузочный краситель в образцы ДНК, которые необходимо разделить ( рис. 2 ). Краситель для загрузки геля обычно производится в концентрации 6X (0.25 % бромфенолового синего, 0,25 % ксилолцианола, 30 % глицерина). Загрузка красителя помогает отслеживать, как далеко прошел образец ДНК, а также позволяет образцу погрузиться в гель.

  2. Запрограммируйте источник питания на желаемое напряжение (1–5 В/см между электродами).

  3. Добавьте достаточное количество рабочего буфера, чтобы покрыть поверхность геля. Важно использовать тот же рабочий буфер, что и для приготовления геля.

  4. Подсоедините провода коробки с гелем к источнику питания.Включите источник питания и убедитесь, что гелевая коробка и источник питания работают.

  5. Снимите крышку. Медленно и осторожно поместите образцы ДНК в гель ( рис. 3 ). Маркер соответствующего размера ДНК всегда следует загружать вместе с экспериментальными образцами.

  6. Замените крышку коробки с гелем. Катод (черные выводы) должен быть ближе к лункам, чем анод (красные выводы). Дважды проверьте, что электроды вставлены в правильные разъемы на блоке питания.

  7. Включите питание. Запустите гель, пока краситель не переместится на соответствующее расстояние.

3. Наблюдение за разделенными фрагментами ДНК

  1. По завершении электрофореза отключите питание и снимите крышку гелевой коробки.

  2. Удалите гель из коробки с гелем. Слейте лишний буфер с поверхности геля. Поместите лоток с гелем на бумажные полотенца, чтобы поглотить лишний буфер.

  3. Удалите гель из лотка для геля и подвергните его воздействию ультрафиолетового излучения.Чаще всего это делается с помощью системы документирования геля (, рис. 4, ). Полосы ДНК должны отображаться как оранжевые флуоресцентные полосы. Сфотографируйте гель ( рис. 5 ).

  4. Утилизируйте гель и рабочий буфер надлежащим образом в соответствии с правилами учреждения.

4. Репрезентативные результаты

На рис. 5 представлен типичный результат электрофореза продуктов ПЦР в агарозном геле. После разделения полученные фрагменты ДНК видны в виде четко очерченных полос.Стандарт или лестница ДНК должны быть разделены до такой степени, чтобы можно было с пользой определить размеры полос образца. В показанном примере фрагменты ДНК размером 765 п.н., 880 п.н. и 1022 п.н. разделяются на 1,5% агарозном геле вместе с 2-логарифмической лестницей ДНК.

Рис. 1. Затвердевший агарозный гель после удаления гребенки.

Рис. 2. Студентка добавляет загрузочный краситель к своим образцам ДНК.

Рисунок 3. Студент загружает образец ДНК в лунку геля.

Рисунок 4. Пример системы документирования геля.

Рисунок 5. Изображение постэлектрофореза в геле. EtBr добавляли в гель перед электрофорезом до конечной концентрации 0,5 мкг/мл с последующим разделением при 100 В в течение 1 часа. Гель подвергали воздействию ультрафиолетового излучения и фотографировали с помощью системы документирования геля.

Обсуждение

Электрофорез в агарозном геле зарекомендовал себя как эффективный и действенный способ разделения нуклеиновых кислот.Высокая прочность геля агарозы позволяет работать с гелями с низким процентным содержанием для разделения больших фрагментов ДНК. Молекулярное сито определяется размером пор, образованных пучками агарозы 7 в гелевой матрице. Как правило, чем выше концентрация агарозы, тем меньше размер пор. Традиционные агарозные гели наиболее эффективны при разделении фрагментов ДНК размером от 100 п.н. до 25 т.п.н. Для разделения фрагментов ДНК размером более 25 т.п.н. необходимо использовать гель-электрофорез в импульсном поле 6 , который включает приложение переменного тока с двух разных направлений.Таким образом, фрагменты ДНК большего размера разделяются по скорости, с которой они переориентируются при изменении направления тока. Фрагменты ДНК менее 100 п.н. более эффективно разделяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. В отличие от агарозных гелей, матрица полиакриламидного геля формируется в результате химической реакции со свободными радикалами. Эти более тонкие гели имеют более высокую концентрацию, работают вертикально и имеют лучшее разрешение. В современном секвенировании ДНК используется капиллярный электрофорез, при котором капилляры заполняются гелевой матрицей.Использование капиллярных трубок позволяет применять высокие напряжения, тем самым обеспечивая быстрое разделение фрагментов ДНК (и определение последовательности ДНК).

Агарозу можно модифицировать для создания агарозы с низкой температурой плавления путем гидроксиэтилирования. Агароза с низкой температурой плавления обычно используется, когда требуется выделение разделенных фрагментов ДНК. Гидроксиэтилирование снижает плотность упаковки пучков агарозы, эффективно уменьшая размер их пор 8 . Это означает, что фрагменту ДНК того же размера потребуется больше времени, чтобы пройти через легкоплавкий агарозный гель, чем через стандартный агарозный гель.Поскольку пучки связываются друг с другом посредством нековалентных взаимодействий 9 , можно повторно расплавить агарозный гель после его затвердевания.

EtBr является наиболее распространенным реагентом, используемым для окрашивания ДНК в агарозных гелях 10 . При воздействии ультрафиолетового света электроны в ароматическом кольце молекулы этидия активируются, что приводит к высвобождению энергии (света), когда электроны возвращаются в основное состояние. EtBr работает, встраиваясь в молекулу ДНК в зависимости от концентрации.Это позволяет оценить количество ДНК в любой конкретной полосе ДНК на основе ее интенсивности. Благодаря положительному заряду использование EtBr снижает скорость миграции ДНК на 15%. EtBr является подозрительным мутагеном и канцерогеном, поэтому необходимо соблюдать осторожность при обращении с агарозными гелями, содержащими его. Кроме того, EtBr считается опасным отходом и должен утилизироваться надлежащим образом. Альтернативные красители для ДНК в агарозных гелях включают SYBR Gold, SYBR green, Crystal Violet и Methyl Blue.Из них метиловый синий и кристаллический фиолетовый не требуют воздействия на гель ультрафиолетового света для визуализации полос ДНК, тем самым снижая вероятность мутации, если желательно извлечение фрагмента ДНК из геля. Однако их чувствительность ниже, чем у EtBr. SYBR gold и SYBR green — высокочувствительные, зависимые от УФ-излучения красители с меньшей токсичностью, чем EtBr, но они значительно дороже. Более того, все альтернативные красители либо не могут быть, либо плохо работают при добавлении непосредственно в гель, поэтому гель необходимо будет окрашивать после электрофореза.Из-за стоимости, простоты использования и чувствительности EtBr по-прежнему остается предпочтительным красителем для многих исследователей. Однако в определенных ситуациях, например, когда утилизация опасных отходов затруднена или когда молодые студенты проводят эксперимент, может быть предпочтительнее менее токсичный краситель.

Загрузочные красители, используемые в гель-электрофорезе, служат трем основным целям. Сначала они добавляют плотности образцу, позволяя ему погрузиться в гель. Во-вторых, красители обеспечивают цвет и упрощают процесс загрузки. Наконец, красители перемещаются через гель со стандартной скоростью, что позволяет оценить расстояние, на которое мигрировали фрагменты ДНК.

Точные размеры разделенных фрагментов ДНК можно определить, построив логарифм молекулярной массы для различных полос стандарта ДНК в зависимости от расстояния, пройденного каждой полосой. Стандарт ДНК содержит смесь фрагментов ДНК заранее определенных размеров, которые можно сравнивать с неизвестными образцами ДНК. Важно отметить, что разные формы ДНК проходят через гель с разной скоростью. Сверхскрученная плазмидная ДНК из-за своей компактной конформации движется через гель быстрее всего, за ней следует линейный фрагмент ДНК того же размера, причем открыто-кольцевая форма движется медленнее всего.

В заключение, с момента принятия агарозных гелей в 1970-х годах для разделения ДНК, они оказались одним из наиболее полезных и универсальных методов в биологических исследованиях.

Электрофорез | Спросите у биолога

Электрофорез в агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле позволяет разделить фрагменты ДНК в зависимости от их размера. Обычно молекулу ДНК расщепляют рестрикционными ферментами, а электрофорез в агарозном геле используют в качестве диагностического инструмента для визуализации фрагментов.Электрический ток используется для перемещения молекул ДНК через агарозный гель, который представляет собой полисахаридную матрицу, функционирующую как своего рода сито. Матрица помогает «улавливать» молекулы, переносимые электрическим током.

Эта техника имеет множество применений. Вообще говоря, вы можете анализировать фрагменты ДНК, полученные в результате ферментативного переваривания более крупного фрагмента ДНК, чтобы визуализировать фрагменты и определить размеры фрагментов.

Электрофорез в агарозном геле не только полезен в исследовательских методах, но и является распространенным методом судебной экспертизы и используется для снятия отпечатков пальцев ДНК.

 

Не могли бы вы просто покраситься?

Бромид этидия является интеркалирующим красителем, что означает, что он встраивается между основаниями, расположенными стопкой в ​​центре спирали ДНК. Одна молекула бромистого этидия связывается с одним основанием. По мере того, как каждая молекула красителя связывается с основаниями, спираль раскручивается, чтобы приспособиться к напряжению от красителя.

Замкнутая кольцевая ДНК ограничена и не может выдерживать такое сильное скручивающее напряжение, как линейная ДНК, поэтому кольцевая ДНК не может связывать такое количество красителя, как линейная ДНК.

Бромид этидия может легко попасть в ваши клетки. ДНК человека линейна и хорошо окрашивается. Это означает, что он может проникнуть в вашу ДНК и раскрутить ее. Это нехорошо, поэтому убедитесь, что вы осторожны и защищены при использовании бромистого этидия.

Существуют также более безопасные и менее токсичные альтернативы, которые вы можете использовать. GelRed и GelGreen — это красители ДНК, которые не могут проникать через клеточные мембраны, что делает их более безопасными в использовании и утилизации.

Перемещение по матрице

Молекулы фосфатов, составляющие основу молекул ДНК, имеют высокий отрицательный заряд.Когда ДНК помещается в поле с электрическим током, эти отрицательно заряженные молекулы ДНК мигрируют к положительному концу поля, которым в данном случае является агарозный гель, погруженный в буферную ванну.

Агарозный гель представляет собой поперечно-сшитую матрицу, напоминающую трехмерную сетку или экран. Молекулы ДНК притягиваются током к положительному концу, но встречают сопротивление со стороны этой агарозной сетки. Молекулы меньшего размера способны перемещаться по сетке быстрее, чем молекулы большего размера, поэтому они продвигаются дальше в геле, чем молекулы большего размера.Вот как электрофорез в агарозе разделяет разные молекулы ДНК в зависимости от их размера. Гель окрашивают бромистым этидием, поэтому вы можете визуализировать, как эти молекулы ДНК распадаются на полосы вдоль геля.

Саузерн-блоттинг также можно использовать в качестве метода визуализации агарозных гелей.

Неизвестные образцы ДНК обычно анализируют на том же геле с помощью «лесенки». Лестница — это образец ДНК, размеры полос которого известны. Таким образом, после того, как вы закончите свой образец, вы можете сравнить неизвестные фрагменты с фрагментами лестницы и определить приблизительный размер неизвестных полос ДНК по тому, как они совпадают с известными полосами лестницы.


Дополнительные изображения из Викимедиа через Jacopo Werther (аппарат для электрофореза) и Mnolf (гель-электрофорез)

Понимание и интерпретация электрофореза белков сыворотки

Доктор медицинских наук, программа резидентуры по семейной медицине Kaiser Permanente Woodland Hills, Вудленд-Хиллз, Калифорния

Am Fam Physician.  1 января 2005 г.; 71(1):105–112.

Электрофорез сывороточного белка используется для выявления пациентов с множественной миеломой и другими нарушениями сывороточного белка.Электрофорез разделяет белки на основе их физических свойств, и подмножества этих белков используются для интерпретации результатов. Уровни белков плазмы демонстрируют достаточно предсказуемые изменения в ответ на острое воспаление, злокачественное новообразование, травму, некроз, инфаркт, ожоги и химические повреждения. Однородный спайкообразный пик в фокальной области зоны гамма-глобулина указывает на моноклональную гаммапатию. Моноклональные гаммапатии связаны с клональным процессом, который является злокачественным или потенциально злокачественным, включая множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, солитарную плазмоцитому, вялотекущую множественную миелому, моноклональную гаммапатию неустановленного значения, лейкоз плазматических клеток, болезнь тяжелых цепей и амилоидоз.Количество белка М, результаты биопсии костного мозга и другие характеристики могут помочь дифференцировать множественную миелому от других причин моноклональной гаммапатии. Напротив, поликлональные гаммапатии могут быть вызваны любым реактивным или воспалительным процессом.

Электрофорез сывороточного белка — это лабораторное исследование, которое обычно используется для выявления пациентов с множественной миеломой и другими нарушениями сывороточного белка. Многие узкие специалисты включают скрининг электрофореза белков сыворотки в первоначальную оценку многочисленных клинических состояний.Однако иногда результаты этого обследования могут сбивать с толку или их трудно интерпретировать.

В этой статье представлен всесторонний обзор электрофореза белков сыворотки, включая обсуждение того, как проводится исследование, что он измеряет и когда он показан. В статье также представлено простое руководство по интерпретации результатов и рекомендации по последующему наблюдению за аномальными результатами.

Определения

Электрофорез – это метод разделения белков на основе их физических свойств.Сыворотку помещают на определенный носитель и прикладывают заряд. Общий заряд (положительный или отрицательный), а также размер и форма белка обычно используются для дифференциации различных белков сыворотки.1

Доступно несколько вариантов электрофореза белков сыворотки. Названия этих подмножеств основаны на методе, используемом для разделения и дифференциации различных компонентов сыворотки. Например, при зональном электрофорезе различные подтипы белков помещают в отдельные физические места на геле, изготовленном из агара, целлюлозы или другого растительного материала.2,3 Белки окрашиваются, и их плотность рассчитывается электронным способом для получения графических данных об абсолютном и относительном количестве различных белков. Дальнейшее разделение белковых подтипов достигается окрашиванием иммунологически активным агентом, что приводит к иммунофлуоресценции и иммунофиксации.

Компоненты электрофореза белков сыворотки

Характер результатов электрофореза белков сыворотки зависит от фракций двух основных типов белков: альбуминов и глобулинов. Альбумин, основной белковый компонент сыворотки, вырабатывается печенью в нормальных физиологических условиях. Глобулины составляют гораздо меньшую часть общего содержания белков сыворотки. Подмножества этих белков и их относительное количество являются основным предметом интерпретации электрофореза белков сыворотки.1,3

Альбумин, самый большой пик, расположен ближе всего к положительному электроду. Следующие пять компонентов (глобулины) обозначены как альфа 1 , альфа 2 , бета 1 , бета 2 и гамма.Пики этих компонентов направлены к отрицательному электроду, а пик гамма-излучения находится ближе всего к этому электроду. На рис. 1 показана типичная нормальная картина распределения белков, определяемая с помощью электрофореза белков сыворотки.


Рисунок 1

Типичная нормальная картина для электрофореза белков сыворотки.

АЛЬБУМИН

Полоска альбумина представляет собой самый большой белковый компонент сыворотки крови человека. Уровень альбумина снижается в условиях, когда печень вырабатывает меньше белка или когда происходит повышенная потеря или расщепление этого белка.Низкий уровень альбумина может быть обусловлен недостаточным питанием, значительным заболеванием печени, поражением почек (например, при нефротическом синдроме), гормональной терапией и беременностью. Ожоги также могут привести к снижению уровня альбумина. Уровни альбумина повышены у пациентов с относительным снижением содержания воды в сыворотке (например, при обезвоживании).

АЛЬФА-ФРАКЦИЯ

Двигаясь к отрицательной части геля (т. е. к отрицательному электроду), следующие пики включают компоненты альфа 1 и альфа 2 .Альфа 1 -белковая фракция состоит из альфа 1 -антитрипсина, тиреоидсвязывающего глобулина и транскортина. Злокачественные новообразования и острое воспаление (в результате реагентов острой фазы) могут увеличить полосу альфа 1 -белка. Пониженная полоса альфа 1 -белка может возникать из-за дефицита альфа 1 -антитрипсина или снижения продукции глобулина в результате заболевания печени. Церулоплазмин, альфа 2 -макроглобулин и гаптоглобин вносят вклад в полосу альфа 2 -белка.Компонент альфа 2 увеличивается как реагент острой фазы.

БЕТА-ФРАКЦИЯ

Бета-фракция имеет два пика, обозначенных как бета 1 и бета 2 . Бета 1 состоит в основном из трансферрина, а бета 2 содержит бета-липопротеин. IgA, IgM, иногда IgG, наряду с белками комплемента, также могут быть идентифицированы в бета-фракции.

ГАММА-ФРАКЦИЯ

Большой клинический интерес сосредоточен на гамма-области спектра белков сыворотки, поскольку иммуноглобулины мигрируют в эту область.Следует отметить, что иммуноглобулины часто можно обнаружить во всем электрофоретическом спектре. С-реактивный белок (СРБ) расположен в области между бета- и гамма-компонентами.1

Показания

Электрофорез сывороточного белка обычно проводится при подозрении на множественную миелому. Исследование также следует рассматривать в других «тревожных» ситуациях (таблица 1). 2–4

Просмотр/печать таблицы

ТАБЛИЦА 1 первичный амилоидоз или родственное заболевание

Необъяснимая периферическая невропатия (не связанная с длительным сахарным диабетом, воздействием токсинов, химиотерапией и т. д.)

Новораловая анемия, связанная с почечной недостаточностью или недостаточностью и костяной болью

Боли в спине, в которой множественная миелома подозревается

Гиперкальцимия, приписываемая возможным злокачественству (например, Потеря, усталость, боль в костях, ненормальное кровотечение)

7

1

почечная недостаточность со связанной спусковой сывороточной белкой высота

необъяснимый патологический перелом или литическое поражение Радиография

7

Bence Jones Proteinuria

161 Таблица 1
Показания для электрофореза сывороточного белка

Необъяснимая периферическая невропатия (не связанная с длительным сахарным диабетом, воздействием токсинов, химиотерапией и т. )

7

Подозреваемая множественная миелома, макроглобулинемия Waldenström, первичный амилоидоз или родственное расстройство

Новораловая анемия, связанная с почечной недостаточностью или недостаточностью и костяной болью

Боли в спине, в которой множественная миелома подозревается

Гиперкальцимия, приписываемая возможным злокачественству (например, Потеря, усталость, боль в костях, ненормальное кровотечение)

1

почечная недостаточность со связанной спусковой сывороточной белкой высота

необъяснимый патологический перелом или литическое поражение рентгенограмма

протеинурия Бенс-Джонса

чувствительный к идентификации небольшого моноклонального (М) белка. 5

Интерпретация результатов

Уровни белков плазмы демонстрируют достаточно предсказуемые изменения в ответ на острое воспаление, злокачественное новообразование, травму, некроз, инфаркт, ожоги и химические повреждения. Этот так называемый «белковый паттерн острой реакции» включает повышение уровня фибриногена, альфа 1 -антитрипсина, гаптоглобина, церулоплазмина, СРБ, С3-фрагмента комплемента и альфа 1 кислого гликопротеина. Часто наблюдается ассоциированное снижение уровней альбумина и трансферрина.6  В таблице 26 перечислены характерные образцы белков острой реакции, обнаруженные при электрофорезе белков сыворотки, а также сопутствующие состояния или расстройства.

Просмотр/печать таблицы

ТАБЛИЦА 2
Характеристика белков с острой реакцией, обнаруженная при электрофорезе белков сыворотки, и ассоциированные состояния или расстройства или энтеропатии с потерей белка Нарушение функции печени в результате снижения синтеза альбумина Недостаточность питания Нефротический синдром Беременность Повышение уровня альфа-
1 глобулинов Беременность Снижение уровня альфа 1 глобулинов сахарный диабет Нефротический синдром Снижение уровня альфа-глобулинов 2 Недостаточность питания Мегалобластная анемия Энтеропатии с потерей белка Тяжелое заболевание печени Болезнь Вильсона

Повышение уровня бета 1 или бета 2 глобулины Билиарный цирроз Карцинома (иногда) Болезнь Кушинга Сахарный диабет (некоторые случаи) Гипотиреоз Железодефицитная анемия Злокачественная гипертензия Нефроз Узелковый полиартериит Механическая желтуха Третий триместр беременности Снижение бета Хронические инфекции (гранулематозные заболевания) Хронический лимфолейкоз Цирроз Болезнь Ходжкина Злокачественная лимфома Множественная миелома Ревматоидные и коллагеновые заболевания (заболевания соединительной ткани) Макроглобулинемия Вальденстрема Снижение уровня гамма-глобулинов Агаммаглобулинемия Гипогаммаглобулинемия

Электрофорез и сопутствующие состояния или расстройства

Повышение уровня альбумина Дегидратация Снижение уровня альбумина Хронические кахектические или истощение Хрони c инфекции Кровотечение, ожоги или энтеропатии с потерей белка Нарушение функции печени в результате снижения синтеза альбумина Недостаточность питания Нефротический синдром Беременность Повышение уровня альфа- 1 глобулинов Беременность Снижение уровня альфа 1 глобулинов Недостаточность надпочечников Адренокортикостероидная терапия Расширенный диабет Mellitus Нефротический синдром Уменьшен Альфа 2 Глобулины недоедания Мегалобластические анемии Белковые энтеропаты тяжелые заболевания печени Болезнь Уилсона

1 8

Увеличение бета 1 или бета-бета 2 Globulins Biliary Circinozy Сахарный диабет (некоторые случаи) Гипотиреоз Железодефицитная анемия Злокачественная гипертензия Нефроз Узелковый полиартериит Механическая желтуха Беременность в третьем триместре Снижение бета 1 или бета 2 globu линами белковую недостаточность Увеличение гамма-глобулинов Амилоидоз хронических инфекций (гранулематозные болезни) хронический лимфолейкоз Цирроз Ходжкина болезнь Злокачественная лимфома Множественная миелома ревматоидным и коллагеновых заболеваний (расстройств соединительной ткани) макроглобулинемии Снижение гамма-Вальденстрема глобулинам АГАММАГЛОБУЛИНЕМИЯ гипогаммаглобулинемией

В интерпретации сывороточного белка При электрофорезе наибольшее внимание уделяется гамма-области, которая состоит преимущественно из антител типа IgG. Зона гамма-глобулина снижена при гипогаммаглобулинемии и агаммаглобулинемии. Заболевания, вызывающие повышение уровня гамма-глобулина, включают болезнь Ходжкина, злокачественную лимфому, хронический лимфолейкоз, гранулематозные заболевания, заболевания соединительной ткани, заболевания печени, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема и амилоидоз.3,7

Хотя многие состояния могут вызывают увеличение гамма-области, некоторые болезненные состояния вызывают однородный шиповидный пик в фокальной области гамма-глобулиновой зоны (рис. 2).Эти так называемые «моноклональные гаммапатии» составляют группу заболеваний, характеризующихся пролиферацией одного клона плазматических клеток, продуцирующих гомогенный белок М6.

Аномальная картина электрофореза белков сыворотки у пациента с множественной миеломой. Обратите внимание на большой всплеск в гамма-диапазоне.


Рисунок 2

Аномальная картина электрофореза белков сыворотки у пациента с множественной миеломой. Обратите внимание на большой всплеск в гамма-диапазоне.

Моноклональные и поликлональные гаммапатии

Крайне важно дифференцировать моноклональные и поликлональные гаммапатии. Моноклональные гаммапатии связаны с клональным процессом, который является злокачественным или потенциально злокачественным. Напротив, поликлональные гаммапатии могут быть вызваны любым реактивным или воспалительным процессом и обычно связаны с незлокачественными состояниями. Наиболее частые состояния при дифференциальной диагностике поликлональной гаммапатии перечислены в таблице 3.8,9

Взгляд / принтной таблица

Таблица 3
Дифференциальная диагностика поликлональной гаммопатии
Инфекции злокачественные новообразования 60635

вирусные инфекции, особенно гепатит, вирусная инфекция человеческого иммунодефицита, мононуклеоз и варикелла Очаговые или системные бактериальные инфекции, включая эндокардит, остеомиелит и бактериемию Туберкулез Заболевания соединительной ткани Системная красная волчанка Смешанная соединительная ткань Височный артериит Ревматоидный артрит Саркоид Заболевания печени Цирроз Злоупотребление этанолом Аутоиммунный гепатит Вирусный гепатит Первичный билиарный цирроз Первичный склерозирующий холангит опухоли Опухоли яичников Рак легкого Гепатоцеллюлярный рак Опухоли почек Опухоли желудка Опухоли желудка Гематологические раковые заболевания (см. ниже) Гематологические и лимфопролиферативные заболевания Лимфома Лейкемия Талассемия Серповидноклеточная анемия Другие воспалительные заболевания Поделиния желудочно-кишечных условий, в том числе язвенного колита и заболевания легочных заболеваний, в том числе бронхит, цистический фиброз, хронический бронхит и пневмонит эндокринные заболевания, включая болезнь могилы и тиреоидита могилы

Таблица 3
дифференциал Диагностика поликлональной гаммопатии

Вирусные инфекции, особенно гепатит, вирусная инфекция человеческого иммунодефицита, мононуклеоз и варикелла. заболевания Системная красная волчанка Смешанная соединительная ткань Височный артериит Ревматоидный артрит Саркоид Заболевания печени Цирроз Злоупотребление этанолом Аутоиммунный гепатит Вирусный гепатит Первичный билиарный цирроз Первичный склероз нг холангит

Несколько миелома

Инфекции INFUCKECTIONS Злообразности

Солидные опухоли Опухоли яичников Рак легких Гепатоцеллюлярный рак Опухоли почек Опухоли желудка Гематологические виды рака (см. ниже) Гематологические и лимфопролиферативные заболевания Лимфома Лейкемия Талассемия Серповидноклеточная анемия Другие воспалительные состояния Желудочно-кишечные заболевания, включая язвенный колит и болезнь Крона Легочные заболевания, в том числе бронхоэктазы, муковисцидоз, хронический бронхит и пневмонит Эндокринные заболевания, включая болезнь Грейвса и тиреоидит Хашимото одиночная тяжелая цепь и аналогичная полоса с легкой каппа- или лямбда-цепью.Поликлональная гаммапатия характеризуется широкой диффузной полосой с одной или несколькими тяжелыми цепями и легкими цепями каппа и лямбда.7

После выявления моноклональной гаммапатии с помощью электрофореза белков сыворотки множественную миелому необходимо дифференцировать от других причин этого типа гаммапатии. . Среди этих других причин — макроглобулинемия Вальденстрема, солитарная плазмоцитома, тлеющая множественная миелома, моноклональная гаммапатия неустановленного значения, лейкемия плазматических клеток, болезнь тяжелых цепей и амилоидоз.4,7

Количество белка М может помочь дифференцировать множественную миелому от моноклональной гаммапатии неопределенного значения. Окончательный диагноз множественной миеломы требует вовлечения 10-15% плазматических клеток, что определяется биопсией костного мозга. Характерные дифференцирующие особенности моноклональных гаммопатий перечислены в таблице 4.7

Взгляд / принт. Таблица

Таблица 4
Характеристики

Таблица 4
Характеристики моноклональных гаммопатий
Болезнь Отличительные особенности
Белок

М выглядит как узкий пик в гамма-, бета- или альфа-областях 2 .

Уровень М-белка обычно превышает 3 г на дл.

Скелетные поражения (например, литические поражения, диффузная остеопения, компрессионные переломы позвонков) присутствуют у 80% пациентов.

Диагноз требует наличия 10-15% плазматических клеток при биопсии костного мозга.

Могут присутствовать анемия, панцитопения, гиперкальциемия и почечная недостаточность.

Моноклональная гаммапатия неустановленной значимости

Уровень М-белка менее 3 г/дл.

При биопсии костного мозга вовлечение плазматических клеток составляет менее 10 процентов.

У пораженных пациентов в моче отсутствует белок М, нет литических поражений костей, нет анемии, гиперкальциемии и почечной недостаточности.

Тлеющая множественная миелома

Уровень М-белка превышает 3 г/дл.

При биопсии костного мозга вовлечение плазматических клеток превышает 10 процентов.

У пострадавших пациентов нет литических поражений костей, анемии, гиперкальциемии и заболеваний почек.

Плазмоклеточный лейкоз

Периферическая кровь содержит более 20% плазматических клеток.

Уровни М-белка низкие

У больных мало поражений костей и мало гематологических нарушений.

Эта моноклональная гаммапатия встречается у молодых пациентов.

Солитарная плазмоцитома

У пораженных пациентов имеется только одна опухоль без других поражений костей и аномалий в моче или сыворотке.

Макроглобулинемия Вальденстрема

IgM Белок M присутствует.

У больных отмечается повышенная вязкость и гиперклеточность костного мозга с обширной инфильтрацией лимфоплазматическими клетками.

Болезнь тяжелых цепей

Белок М имеет неполную тяжелую цепь и не имеет легкой цепи.

Таблица 4
Характеристики моноклональных гаммопатий

Несколько миелома

Болезнь Отличительные особенности Отличительные особенности

M Белок появляется как узкий всплеск в гамме, бета-версии или альфа 2 регионов.

Уровень М-белка обычно превышает 3 г на дл.

Скелетные поражения (например, литические поражения, диффузная остеопения, компрессионные переломы позвонков) присутствуют у 80% пациентов.

Диагноз требует наличия 10-15% плазматических клеток при биопсии костного мозга.

Могут присутствовать анемия, панцитопения, гиперкальциемия и почечная недостаточность.

Моноклональная гаммапатия неустановленной значимости

Уровень М-белка менее 3 г/дл.

При биопсии костного мозга вовлечение плазматических клеток составляет менее 10 процентов.

У пораженных пациентов в моче отсутствует белок М, нет литических поражений костей, нет анемии, гиперкальциемии и почечной недостаточности.

Тлеющая множественная миелома

Уровень М-белка превышает 3 г/дл.

При биопсии костного мозга вовлечение плазматических клеток превышает 10 процентов.

У пострадавших пациентов нет литических поражений костей, анемии, гиперкальциемии и заболеваний почек.

Плазмоклеточный лейкоз

Периферическая кровь содержит более 20% плазматических клеток.

Уровни М-белка низкие

У больных мало поражений костей и мало гематологических нарушений.

Эта моноклональная гаммапатия встречается у молодых пациентов.

Солитарная плазмоцитома

У пораженных пациентов имеется только одна опухоль без других поражений костей и аномалий в моче или сыворотке.

Макроглобулинемия Вальденстрема

IgM Белок M присутствует.

У больных отмечается повышенная вязкость и гиперклеточность костного мозга с обширной инфильтрацией лимфоплазматическими клетками.

Болезнь тяжелых цепей

Белок М имеет неполную тяжелую цепь и не имеет легкой цепи.

У некоторых пациентов с дискразией плазматических клеток электрофорез белков сыворотки может быть нормальным, поскольку полный моноклональный иммуноглобулин отсутствует или присутствует на очень низком уровне. группа только у 82 процентов пациентов с множественной миеломой.У остальных была гипогаммаглобулинемия или нормальная картина. Следовательно, электрофорез белков мочи рекомендуется всем пациентам с подозрением на дискразию плазматических клеток. Хотя этот выброс обычно превышает 3 г/дл у пациентов с множественной миеломой, до одной пятой пациентов с этой опухолью может иметь выброс М-белка менее 1 г/дл. Гипогаммаглобулинемия при электрофорезе белков сыворотки возникает примерно через 10 процентов пациентов с множественной миеломой, у которых нет спайка М-белка в сыворотке.11 Большинство этих пациентов имеют большое количество белка Бенс-Джонса (моноклональная свободная каппа- или лямбда-цепь) в моче. 11 Таким образом, размер пика М-белка не помогает исключить множественную миелому.

Если множественная миелома по-прежнему подозревается клинически у пациента, у которого нет пика М-белка при электрофорезе белков сыворотки, следует провести электрофорез белков мочи.

Оценка аномального электрофореза белка сыворотки

Моноклональная гаммапатия присутствует у 8% здоровых пожилых пациентов.12 Все пациенты с моноклональной гаммапатией нуждаются в дальнейшем обследовании для определения причины патологии. Пациенты с моноклональной гаммапатией неопределенной значимости требуют тщательного наблюдения, поскольку примерно у 1% в год развивается множественная миелома или другая злокачественная моноклональная гаммапатия.13 [Уровень доказательности B, проспективное когортное исследование] Алгоритм наблюдения за пациентами с моноклональной гаммапатией представлен на рис. 3.6

Просмотр/печать Рис.(SPEP = электрофорез белков сыворотки) Информация из ссылки6.


Рисунок 3

Предлагаемый алгоритм наблюдения за моноклональной гаммапатией. (SPEP = электрофорез белков сыворотки) Информация из ссылки6.

Если выброс М-белка в сыворотке составляет от 1,5 до 2,5 г/дл, важно выполнить нефелометрию для количественного определения присутствующих иммуноглобулинов и получить 24-часовой сбор мочи для электрофореза и иммунофиксации. Если эти исследования в норме, электрофорез белков сыворотки следует повторить через три-шесть месяцев; если это исследование нормальное, электрофорез белков сыворотки следует повторять ежегодно.Если повторное обследование не соответствует норме или будущие картины не соответствуют норме, следующим шагом является направление пациента к гематологу-онкологу.

Всплеск М-белка более 2,5 г на дл следует оценивать с помощью обследования метастазов в костях, которое включает однократную проекцию плечевых и бедренных костей. Кроме того, следует провести тест на микроглобулин бета 2 , тест на СРБ и 24-часовой сбор мочи для электрофореза и иммунофиксации. При подозрении на макроглобулинемию Вальденстрема или другой лимфопролиферативный процесс следует выполнить компьютерную томографию брюшной полости, аспирацию и биопсию костного мозга.Отклонения в любом из этих тестов должны привести к направлению к гематологу-онкологу. Если все тесты в норме, можно проводить последующее наблюдение, показанное на рис. 36. Если электрофорез сывороточного белка показал отклонения от нормы в какой-либо момент наблюдения, следует обратиться к специалисту по телефону

Электрофорез в агарозном геле, как он работает и его применение

Простые законы физики гласят, что при подаче тока на среду, содержащую заряженные частицы, эти частицы будут мигрировать в сторону противоположного заряда.В зависимости от среды, через которую они перемещаются, другие характеристики, такие как размер присутствующих видов, могут повлиять на их движение, что приведет к разделению. Это основа, на которой построены методы электрофореза, такие как электрофорез в агарозном геле, которые широко используются в науках о жизни.

В этой статье мы рассмотрим, как работает электрофорез в агарозном геле, как его можно интерпретировать и некоторые его цели.

Что такое электрофорез?

Электрофорез — это метод, использующий электрический ток для разделения ДНК, РНК или белков на основе их физических свойств, таких как размер и заряд.

Что такое электрофорез в агарозном геле?

Электрофорез в агарозном геле — это форма электрофореза, используемая для разделения фрагментов нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) в зависимости от их размера. Отрицательно заряженная ДНК / РНК мигрирует через поры агарозного геля к положительно заряженному концу геля при приложении электрического тока, при этом более мелкие фрагменты мигрируют быстрее. Полученные полосы затем можно визуализировать с помощью ультрафиолетового (УФ) света.


РНК, 1 , однако, имеет тенденцию образовывать вторичные структуры – иногда несколько разных видов для одного и того же фрагмента – которые влияют на то, как она мигрирует. Следовательно, наблюдаемые полосы не всегда отражают их истинные размеры, и изображения получаются размытыми. Нативные агарозные гели (где условия не нарушают естественные структуры аналитов) поэтому, как правило, не используются для анализа размеров РНК, хотя они могут дать оценку количества и целостности. Альтернативы включают нозерн-блоттинг и денатурирующий электрофорез в агарозном геле 2 .


Агарозные гели также можно использовать для разделения белков 3 в зависимости от их размера и заряда (в отличие от ДНК/РНК, заряд белков зависит от включенных в них аминокислот). Однако из-за больших размеров пор в агарозных гелях белки часто разделяют на полиакриламидных гелях, которые вместо этого имеют более мелкие поры, что обеспечивает большее разрешение для небольших белковых молекул.


Поэтому в оставшейся части этой статьи мы сосредоточимся на электрофорезе ДНК в агарозном геле.

Как работает гель-электрофорез?

Агароза является компонентом агара. Он образует трехмерную гелевую матрицу спиральных молекул агарозы в суперскрученных пучках, удерживаемых водородными связями, с каналами и порами, через которые могут проходить молекулы. При нагревании эти водородные связи разрываются, превращая агарозу в жидкость и позволяя вылить ее в форму до того, как она вернется в исходное состояние (рис. 1).
 


Рис. 1: Порообразование и температурно-индуцированный переход состояний в агарозном геле.


Процентное содержание агарозы в геле влияет на размер пор и, следовательно, на размер молекул, которые могут проходить через них, и на скорость, с которой они это делают. Чем выше процентное содержание агарозы, тем меньше размер пор, следовательно, тем меньше молекул, способных пройти, и тем медленнее миграция. В лаборатории молекулярной биологии для повседневного разделения ДНК обычно используется 0,7-1% агарозный гель, обеспечивающий хорошую и четкую дифференциацию фрагментов в диапазоне 0,2-10 т.п.о. Более крупные фрагменты могут быть разделены с использованием гелей с более низким процентным содержанием, но они становятся очень хрупкими и трудными в обращении, в то время как гели с более высоким процентным содержанием обеспечивают лучшее разрешение мелких фрагментов, но являются хрупкими и могут затвердевать неравномерно.


Поскольку ДНК не видна невооруженным глазом, во время отверждения в гель вводится интеркалирующий краситель, такой как бромид этидия (EtBr). Это связывает ДНК и флуоресцирует в ультрафиолетовом свете, позволяя визуализировать фрагменты ДНК. Чем больше присутствует ДНК, тем ярче полоса.


Образцы, смешанные с загрузочным красителем, помещаются в один конец геля, который погружается в подвижный буфер. Затем электрический ток пропускают через гель с помощью электродов на каждом конце бака с гелем (рис. 2).
 


Рис. 2: Иллюстрация установки для электрофореза в агарозном геле. Агарозный гель помещается в емкость с буфером, образцы, смешанные с загрузочным красителем, помещаются в лунки на одном конце геля, и подается электрический ток, заставляющий отрицательно заряженную ДНК двигаться к положительному электроду (катоду).


Когда образцы пробежали достаточно далеко, чтобы получить достаточное разделение, гель удаляют из резервуара и помещают в коробку с УФ-светом. Затем интеркалирующий краситель позволяет визуализировать полосы образца и определить их размер по сравнению с лестницей ДНК с известными размерами полос.Связь между расстоянием миграции и размером фрагмента нелинейна, что повышает важность включения маркеров размера в качестве ориентира (рис. 3).
 


Рисунок 3: A) На приведенном выше рисунке показан типичный результат электрофореза ДНК. Слева находится маркер размера, который используется в качестве эталона длины фрагментов ДНК образца (в парах оснований). Справа от маркера находятся три образца: образец A, образец B и образец C. На изображении показано, как более мелкие фрагменты ДНК продвигаются дальше через агарозный гель, чем более крупные фрагменты ДНК.B) График справа от изображения показывает нелинейную зависимость между размером фрагментов ДНК и пройденным расстоянием. Это отрицательная кривая, и по мере того, как фрагменты ДНК становятся больше, они мигрируют через гель на меньшее расстояние. Авторы и права: Mckenzielower, воспроизведено по лицензии Creative Commons Attribution-Share Alike 4.0 International .

Этапы гель-электрофореза ДНК, аппарат для гель-электрофореза, буфер для электрофореза и электрическое разделение

Существует ряд ключевых этапов 4 , связанных с выбором, настройкой, запуском и анализом агарозных гелей, которые мы сейчас рассмотрим. .

1.       Определите требуемый процент геля – 0,7–1% агарозного геля обычно достаточно для большинства применений, но важно выбрать процент, соответствующий вашим образцам и ожидаемым размерам фрагментов. Смешайте порошок агарозы с тем же буфером типа , который будет использоваться для запуска геля, и нагрейте, чтобы смесь расплавилась, избегая кипения. Трис-ацетат-этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (ТАЭ) или трис-борат-ЭДТА (ТВЕ) 5 часто являются предпочтительными буферами, поскольку растворы трис-кислоты являются эффективными буферами для слабощелочных условий, сохраняя ДНК депротонированной и растворимой в вода.ЭДТА, хелатирующий агент, инактивирует нуклеазы, которые могут повредить анализируемую ДНК.


2.       Залить гель – Выберите форму для литья геля и гребенку нужного размера, обеспечивающую достаточное количество лунок для всех образцов и лестниц, а также вместимость лунок для размещения количества каждого загружаемого образца. Закрепите открытые концы формы литейной рамкой или лентой, чтобы удерживать гель во время его затвердевания. Добавьте на дно формы интеркалирующий краситель DNA – для EtBr 0.Обычно используется 2-0,5 мкг/мл. Доказательства того, что EtBr является мутагеном, в настоящее время все еще обсуждаются, но, следовательно, многие лаборатории перешли на альтернативы 6 , такие как GelRed. Добавьте гель, стараясь не переполнить форму, и убедитесь, что интеркалирующий краситель равномерно перемешан. Не наливайте гель, когда он слишком горячий, иначе форма может деформироваться или сломаться.


3.       Смешайте образцы/лестницы с загрузочным красителем Загрузочные красители выполняют несколько функций. Они позволяют пользователю видеть, где находится его бесцветный образец, что облегчает точное пипетирование образца в лунку и, таким образом, снижает вероятность перекрестного загрязнения образцов между лунками.Когда гель работает, краситель мигрирует вместе с образцом, позволяя пользователю определить, где в геле находится образец, и предотвратить его перемещение слишком далеко и потерю в буфере. Образцы ДНК без загрузки красителя также имеют тенденцию диспергироваться в рабочем буфере при загрузке, поскольку они менее плотные. Поэтому большинство красителей для нанесения содержат глицерин или фиколл, которые делают смесь образца и красителя более плотной, поэтому она оседает на дне лунок. Бромфеноловый синий является популярным красителем, но некоторые из них также содержат дополнительные красители, такие как ксилолцианол.Хотя загрузочные красители можно купить, многие лаборатории предпочитают изготавливать их самостоятельно. 7


Если вы работаете с очень небольшими объемами пробы (например, менее 5 мкл), может оказаться полезным добавить немного воды на этом этапе, чтобы облегчить эффективную загрузку гелевых лунок. и равномерно. Точно так же, если вы ожидаете, что концентрация ДНК в некоторых образцах будет намного выше, чем в других, может также потребоваться добавить воду в смесь этих концентрированных образцов с красителем на этом этапе.Если вы этого не сделаете, сильный сигнал, подаваемый этими полосами во время визуализации, может маскировать более слабые полосы или потребовать чрезмерной экспозиции сильных полос для просмотра более слабых, создавая яркие искаженные области на изображении геля.


4.       Загрузите гель – Снимите литейную рамку/ленту с затвердевшего геля и поместите ее в резервуар для геля, убедившись, что лунки находятся на отрицательном конце (черные электроды). Заполните бак рабочим буфером (TAE или TBE) так, чтобы гель был погружен в воду.Осторожно снимите гребенку и аккуратно пипеткой внесите в лунки образец красителя (и воду, если она используется). Старайтесь не касаться кончиком пипетки краев лунок, так как они могут сломаться и позволить одному образцу попасть в другой. К такому же результату может привести перегрузка скважин. Большое количество ДНК также может замедлить миграцию ДНК во время бега. Загрузите маркерных лестницы , предпочтительно по одной на каждом конце ряда образцов. Гели не всегда могут располагаться по идеально прямой линии, поэтому наличие лестницы на каждом конце облегчает определение размеров присутствующих фрагментов.Доступны различные лестницы с указанием различных размеров; выберите тот, который наиболее подходит для размеров фрагментов, которые вы ожидаете увидеть.


5.       Запустите гель – Наденьте крышку на резервуар с электродами черный к черному и красный к красному и подключите электроды к блоку питания, также черный к черному и красный к красному. Вместе с резервуаром для геля он составляет аппарат для гель-электрофореза . Убедитесь, что электроды и крышка установлены правильно, иначе ваши образцы будут вытекать из лунок в обратном направлении в рабочий буфер.Установите время и напряжение, при котором будет работать ваш гель; 120 В в течение 35 минут является хорошим приближением, однако оно должно быть адаптировано к используемому процентному содержанию геля и ожидаемым размерам разделяемых фрагментов, чтобы обеспечить хорошее электрическое разделение . Подача тока на агарозный гель приведет к его нагреву, чем выше напряжение, тем больше он будет нагреваться, поэтому при работе с гелями с низким процентным содержанием рекомендуется использовать более низкие напряжения, чтобы предотвратить плавление. Может возникнуть соблазн увеличить напряжение, чтобы гель работал быстрее.Однако это может привести к «гелю-смайлику», когда полосы изогнуты вверх на каждом конце, что затрудняет определение правильного размера полосы. Здесь гель начал слегка таять, из-за чего полосы шли неравномерно. Это также может привести к тому, что полосы будут размытыми и плохо очерченными.


6.       Визуализация . После того, как образцы пройдут большую часть пути вниз по гелю (краситель сделает это видимым), выключите блок питания. Надев перчатки, осторожно извлеките гель в форме из резервуара, сливая излишки рабочего буфера, и перенесите в УФ-бокс в соответствующем контейнере для визуализации.Смените перчатки, чтобы предотвратить загрязнение окружающих поверхностей, дверных ручек и т. д. интеркалирующим красителем из геля или бегущего буфера. Если фрагменты ДНК необходимы для последующего применения, соответствующие полосы можно осторожно вырезать из геля с помощью лезвия скальпеля, помещая его в коробку с УФ-светом в темной комнате. Убедитесь, что вы носите защитную маску для лица от ультрафиолетового излучения и держите кожу закрытой, когда световой короб включен, чтобы предотвратить повреждение кожи или глаз ультрафиолетовым светом.
 

Как читать результаты гель-электрофореза

Агарозные гели можно визуализировать с помощью УФ-светильника в темной комнате или с помощью автономного светового короба, подключенного к камере.Какая бы система ни использовалась, УФ-свет проходит через гель снизу, и полосы ДНК флуоресцируют благодаря интеркалирующему красителю, связанному с ними. Это можно зафиксировать с помощью камеры со специальным УФ-фильтром для ваших записей. Лестницы маркеров поставляются с направляющей для указания размера каждой группы, которую они включают. Поэтому, сравнивая это с полосами на пробных дорожках, можно определить размеры полос. Относительное количество ДНК между образцами также можно сравнить, поскольку более высокие концентрации ДНК будут давать более яркие полосы.Пример показан на рисунке 4.
 


Рисунок 4: Агарозный гель (2%) анализ ПЦР-амплифицированных продуктов из ДНК, извлеченной из диагностического образца бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) пациента с легочными симптомами. Кредит: Центры по контролю и профилактике заболеваний.

Какова цель гель-электрофореза?

Существует ряд причин, по которым желательно разделение фрагментов ДНК, многие из которых широко применимы в биологических дисциплинах.Рассмотрим некоторые общие цели.
 

  • Визуализация образца ДНК
    Разделение и визуализация фрагментов ДНК позволяет пользователю определить:

    Наличие ДНК в образце сработал, и поэтому в контексте диагностического теста может определить, является ли образец положительным или отрицательным.

    Размеры присутствующих фрагментов ДНК
    – При проведении ПЦР или рестрикции, например, соответствует ли полоса ожидаемому размеру? Это может подтвердить, были ли генно-инженерные эксперименты успешными, или может указать на наличие или отсутствие генетических вставок, делеций 8 или повторяющихся областей 9 , которые можно использовать в качестве диагностического инструмента для некоторых генетических состояний.При подготовке ДНК для секвенирования следующего поколения важно, чтобы фрагментированная ДНК для подготовки библиотеки имела правильный размер для эффективного секвенирования.

    Количество присутствующей ДНК
    – Хотя существуют более точные методы количественного определения ДНК, 10 , такие как спектроскопия в ультрафиолетовой и видимой областях, при обработке образцов на геле интенсивность образующейся полосы может дать приблизительную представление о количестве ДНК в образце по отношению к другим образцам.

    Степень чистоты образца
    – Хотя в некоторых случаях, например, при анализе цельной геномной ДНК, можно ожидать появления размытой полосы, в ПЦР или рестрикционном расщеплении обычно можно ожидать четкой, четкой полосы. Рассеянные полосы или мазки могут указывать на субоптимальные условия ПЦР или праймеры, неполное расщепление или наличие мешающих примесей, таких как РНК, в случае образца ДНК.
     
  • Разделение фрагментов ДНК для очистки
    Если фрагменты ДНК требуются для последующих применений, таких как клонирование, 11 или после рестрикционного расщепления, может быть желательно отделить фрагменты ДНК определенного размера от других в общая выборка.Для этого расщепленный или амплифицированный образец можно нанести на гель, а кусок геля, содержащий интересующие фрагменты, вырезать. Наборы для очистки и протоколы 12 , 13 доступны для очистки ДНК из агарозного геля перед переходом к последующим этапам.
     
  • Разделение фрагментов ДНК для Саузерн-блоттинга
    Саузерн-блоттинга — это метод, используемый для обнаружения определенных последовательностей ДНК в образце. Однако для этого фрагменты ДНК сначала необходимо разделить с помощью электрофореза в агарозном геле, прежде чем их можно будет исследовать на наличие целевых последовательностей.
     
  • Анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) 
    EMSA, 14 , также называемые анализами сдвига в геле, используются для обнаружения взаимодействий между белками и нуклеиновыми кислотами. Примеры могут включать связывание факторов транскрипции 15 , которые стимулируют или предотвращают экспрессию генов. Когда белок связывается с фрагментом ДНК, он меняет способ своей миграции через агарозный гель, вызывая «сдвиг». Таким образом, используя различные комбинации фрагментов ДНК с предполагаемым ДНК-связывающим белком и без него, можно определить, произошло или не произошло связывание, и, таким образом, определить последовательность-мишень.

ДНК в агарозном геле глоссарий

Термин

Определение

Электрофорез в агарозном геле

Форма электрофореза используется для разделения макромолекулы, такие как фрагменты ДНК, в агарозной матрице.

Хелатирующий агент

Химическое соединение, которое реагирует с ионами металлов с образованием стабильных водорастворимых комплексов металлов.

Денатурирующие агарозные гели

Агарозные гели работают в условиях, которые нарушают естественную структуру ДНК, РНК или белков, заставляя их разворачиваться.

Депротонирование

Удаление протона (H + ).

Лестница ДНК/маркерная лестница

Раствор фрагментов ДНК известных размеров, который можно использовать для экстраполяции размеров фрагментов в неизвестных образцах.

Электрическое разделение

Разделение биомолекул, таких как ДНК, РНК или белки, в зависимости от их размера и/или заряда с помощью электрического тока.

Электрофорез

Метод, использующий электрический ток для разделения ДНК, РНК или белков на основе их физических свойств, таких как размер и заряд.

Анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSA)

Также называемые анализами сдвига в геле, EMSA представляют собой основанный на электрофорезе метод, используемый для обнаружения взаимодействий между белками и нуклеиновыми кислотами.

Аппарат для гель-электрофореза

Оборудование, используемое для проведения гель-электрофореза, которое обычно состоит из емкости с гелем и блока питания с соединительными электродами.

Интеркалирующий краситель

Красители, связывающие двухцепочечную ДНК, что позволяет их визуализировать в УФ-свете.

Загрузочный краситель

Краситель, используемый для подготовки цепочек ДНК и образцов для электрофореза, который позволяет их видеть невооруженным глазом и увеличивает их плотность для предотвращения дисперсии.

Мутаген

Химическое или физическое явление, вызывающее ошибки в репликации ДНК.

Нативные агарозные гели

Агарозные гели работают в условиях, позволяющих сохранить естественную структуру биомолекул, таких как ДНК, РНК или белки.

Нозерн-блоттинг

Метод, используемый для обнаружения специфических последовательностей РНК в образце, который использует электрофорез для разделения образцов.

Нуклеазы

Ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты, такие как ДНК или РНК.

Электрофорез в полиакриламидном геле

Форма электрофореза, используемая для разделения макромолекул, таких как нуклеиновые кислоты и белки, в полимеризованной акриламидной матрице.

Рестриктивное расщепление

Процесс, в котором используются ферменты для разрезания ДНК в определенных местах в соответствии с окружающей последовательностью ДНК.

Рабочий буфер

Буфер, используемый для заполнения бака, в который погружен гель и который будет работать. Это помогает поддерживать стабильные условия.

Вторичная структура

Трехмерная структура, принятая полипептидом или полинуклеотидом в результате электростатического притяжения между соседними остатками.

Саузерн-блоттинг

Метод, используемый для обнаружения определенных последовательностей ДНК в образце, который использует электрофорез для разделения образцов.

Факторы транскрипции

Белки, участвующие в процессе преобразования или транскрипции ДНК в РНК.

Ссылки


1. Рио, округ Колумбия, Арес М., Хэннон Г.Дж., Нильсен Т.В. Неденатурирующий электрофорез РНК в агарозном геле. Протокол Колд Спринг Харб . 2010;2010(6):pdb.prot5445. doi:10.1101/pdb.prot5445

2. Масек Т., Вопаленский В., Сухомелова П., Посписек М.Электрофорез денатурирующей РНК в агарозных гелях ТАЕ. Анальная биохимия . 2005;336(1):46-50. doi:10.1016/j.ab.2004.09.010

3. Krizek DM, Rick ME. Электрофорез белков в агарозном геле. Curr Protoc Cell Biol . 2002;15(1):6.7.1–6.7.13. doi:10.1002/0471143030.cb0607s15

4. Lee PY, Costumbrado J, Hsu CY, Kim YH. Электрофорез в агарозном геле для разделения фрагментов ДНК. J Vis Exp . 2012;(62):3923. doi:10.3791/3923

5. Сандерсон Б.А., Араки Н., Лилли Дж.Л., Герреро Г., Льюис Л.К.Модификация архитектуры геля и буферного состава TBE/TAE для сведения к минимуму нагрева во время электрофореза в агарозном геле. Анальная биохимия . 2014; 454:44-52. doi:10.1016/j.ab.2014.03.003

6. Холл AC. Сравнение окрашивания ДНК и методов окрашивания для электрофореза в агарозном геле. биоРксив . 2019. doi:10.1101/568253

7. Краситель для загрузки геля ДНК (10X). Протокол Колд Спринг Харб . 2008; 2008(8):pdb.rec11373. doi:10.1101/pdb.rec11373

8. Schwarz MJ.ДНК-диагностика муковисцидоза. Энн Клин Биохим . 1998;35(5):584-610. doi:10.1177/000456329803500502

9. Марвал А., Саху А.К., Гаур Р.К. Глава 16. Молекулярные маркеры: инструмент для генетического анализа. В: Верма А.С., Сингх А., ред. Биотехнология животных . Академическая пресса; 2014: 289-305. doi:10.1016/B978-0-12-416002-6.00016-X

10. Tweedie JW, Stowell KM. Количественное определение ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле и анализ топоизомеров плазмиды и ДНК M13 после обработки эндонуклеазой рестрикции или ДНК-топоизомеразой I. Биохим Мол Биол Эдюк . 2005;33(1):28-33. doi:10.1002/bmb.2005.494033010410

11. Molnar C, Gair J. Глава 10.1 Клонирование и генная инженерия. В: Концепции биологии . Опубликовано в Интернете 14 мая 2015 г. По состоянию на 2 февраля 2022 г. https://opentextbc.ca/biology/chapter/10-1-cloning-and-genetic-engineering/

12. Balletbó A. Очистка ДНК из агарозного геля (протокол для набора NucleoSpin® pCR для очистки геля для экстракции). протоколы.io . Опубликовано 22 сентября 2019 г.По состоянию на 2 февраля 2022 г. doi:10.17504/protocols.io.7hrhj56

13. Дауни Н. Экстракция ДНК из агарозных гелей. В: Казали Н., Престон А., ред. Плазмидные векторы E. coli: методы и применение . Методы молекулярной биологии TM . Хумана Пресс; 2003: 137-139. doi:10.1385/1-59259-409-3:137

14. Хеллман Л.М., Фрид М.Г. Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) для обнаружения взаимодействий белок-нуклеиновая кислота. Нацпроток . 2007;2(8):1849-1861.doi:10.1038/nprot.2007.249

15. Юсаф Н., Гулд Д. Демонстрация взаимодействия факторов транскрипции с ДНК с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности. В: Гулд Д., изд. Синтетические промоутеры млекопитающих . Методы молекулярной биологии. Спрингер; 2017: 11-21. doi:10.1007/978-1-4939-7223-4_2

  

.